Achados patológicos e incidentais em anuros do Ceará, nordeste brasileiroResumo
Anfíbios são um dos grupos de vertebrados mais ameaçados globalmente, e os anuros são sua ordem mais representativa. Doenças infecciosas emergentes têm sido associadas ao declínio global das espécies de anfíbios, fenômeno relatado em todo o mundo. Na região Nordeste, o Ceará tem uma abundante anurofauna, com cerca de 5% de suas espécies sendo consideradas criticamente ameaçadas. Em projetos de pesquisa, várias patologias são observadas em anuros silvestres locais, contudo, poucos casos têm sido publicados. O objetivo deste trabalho foi reunir achados patológicos e incidentais em anuros nativos do estado do Ceará, nordeste do Brasil. Os achados foram registrados durante necrópsias e exames clínicos. A amostra incluiu 38 espécimes, distribuídos em 13 espécies, originários de 13 localidades, examinados entre 2010 e 2022. A maioria das lesões (71%, n = 38) apontou para fisiopatologia inflamatória, incluindo infecções parasitárias com agentes lesionais - lesões granulomatosas e necrotizantes com inclusões intracitoplasmáticas, compatíveis com Mycobacteria e Ranavírus, respectivamente. Fibrolipoma e carcinoma hepatocelular se apresentaram como nódulos únicos, estando o último associado a uma infecção helmíntica cística. Calcinose hepática difusa representou doença de etiologia tóxico/metabólica. Catarata bilateral foi a alteração ocular mais frequente (60%, n=5), mas sem diagnóstico etiológico conclusivo. Indícios de doenças infecciosas foram detectados e necessitam de técnicas complementares de diagnóstico etiológico. A falta de laboratórios locais ou parceiros com técnicas diagnosticas específicas limitou alguns diagnósticos definitivos. Os achados aqui apresentados colocam o estado do Ceará no mapa de doenças preocupantes da anurofauna, que necessitam ser monitoradas.
Abstract
Amphibians are among the most threatened animal groups on Earth, with anurans representing the most prevalent order within this group. Globally, emerging infectious diseases are linked to the decline of amphibian populations, a phenomenon also observed in northeastern Brazil. In particular, the state of Ceará boasts a rich and abundant anurofauna, with nearly 5% of its species considered critically endangered. Despite numerous pathologies observed in local anurans through research projects, published cases remain scarce. This study aimed to compile pathological and incidental findings in native anurans from Ceará State, Northeastern Brazil. Data were derived from necropsies and clinical examinations conducted on 38 specimens across 13 species from 13 sites, spanning from 2010 to 2022. Most lesions (71 %, n = 38) indicated inflammatory pathophysiology, with observations of parasitic infections and agents within lesions, granulomatous or necrotic lesions with intracytoplasmic inclusions consistent with Mycobacteria ana Ranavirus infections, respectively. Fibrolipomas and hepatocellular carcinoma presented as single solid nodules, the latter associated with cystic helminth infections. Diffuse hepatic calcinosis suggested a toxic/metabolic etiology. Bilateral cataract was the most common ocular alteration (60%, n=5), though its etiology remained undetermined. The presence of infectious diseases was confirmed, and further etiological diagnostics are necessary. The lack of specific etiological techniques constrained some definitive diagnoses. These findings place Ceará on the distribution map for significant diseases affecting anurofauna, underscoring the need for ongoing monitoring.
Keywords:
amphibians; cataract; infectious diseases; necropsy; neoplasms
1. Introdução
A ordem Anura é a de maior diversidade e representatividade entre os anfíbios, com aproximadamente 7568 espécies(1) distribuídas em praticamente todos os continentes, com exceção das regiões congeladas(2). Suas populações são altamente vulneráveis às variações do ambiente(3), devido a sua fisiologia metabólica e reprodutiva, com grande diversidade de modos reprodutivos, cada um dependente de condições ambientais ótimas e específicas(45). Por conta das condições previamente citadas, esses animais representam um dos grupos mais ameaçados do planeta(5).
Dentre as doenças de maior importância em anfíbios estão as infecções por Batrachochytrium dendrobatitis (chamado frequentemente de 'quitrídio') e Ranavirus, doenças emergentes relacionadas com o declínio global das espécies(7,8,9) . Enquanto a infecção por quitrídio tem sido registrada em diversas espécies no Brasil por pelo menos 15 anos(10,11), apenas recentemente infecções por Ranavírus foram registradas em populações silvestres(12). As doenças infecciosas e parasitárias podem causar efeitos extremamente negativos nas populações e comunidades de anfíbios, que podem ser aumentados sinergicamente por múltiplos fatores, tais como, mudanças climáticas, fragmentação de habitat, poluição e depressão endogâmica em pequenas populações(13). Além disso, Mycobacterium sp. e infecções fúngicas podem atingir anfíbios e constituem questões de saúde pública(14,15,16).
O estado do Ceará possui atualmente 57 espécies registradas de anfíbios(17,18), sendo que quatro destas são endémicas e três são consideradas criticamente ameaçadas de extinção(19). Infecções por Ranavírus e quitrídio causam preocupação no tocante às espécies endémicas e ameaçadas de extinção(20). Embora essas doenças ainda não tenham sido formalmente reportadas no Ceará, já foram registradas em estados vizinhos(21, 22). No entanto, algumas patologias menores têm sido observadas em anuros nativos, mas não têm sido formalmente publicadas, ou são apenas citadas sem muito destaque em estudos ecológicos. Micobacterioses têm sido relatadas pontualmente (Braga, dados não publicados) e mais recentemente levantadas por estudos de biologia molecular em anuros(23). Além disso, as infecções por helmintos e ácaros estão inseridas em estudos de descrição taxonômica e ecologia parasitária(24,25,25,27), mas nem sempre têm sua consequência patogênica descrita. Alterações metabólicas, como mineralizações orgânicas, consideradas restritas aos indivíduos in situ, podem ser enzoóticas em animais de produção(28), mas raramente são descritas em animais silvestres(29) e apenas um relato em anfíbios (Braga, dados não publicados).
O objetivo deste trabalho foi reunir os achados patológicos incidentais em anuros coletados em diferentes localidades do estado no Ceará, nordeste do Brasil, examinados por mais de uma década.
2. Material e métodos
2.1. Área de estudo, amostragem e aspectos éticos
De 2010 a 2022, foram examinadas diferentes espécies de anuros, coletados em diferentes municípios do estado do Ceará (nordeste do Brasil), por ocasião de projetos de pesquisa para pós-graduação e monitoramento local. A coleta dos indivíduos foi autorizada por diferentes licenças (DCL #22909-1; DPC # 39073-4; PMG # 58724-1; RWA #29613, RRB #82318) expedidas pelo Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SisBIO) do Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio), por ocasião da vigência de cada projeto de pesquisa. A amostragem foi por conveniência.
Os indivíduos foram coletados por busca ativa ou captura em armadilhas de queda (pitfalls), em horários crepusculares e noturnos. Depois de coletados, foram identificados e submetidos à biometria (medição do comprimento rostro-cloacal [CRC] e da massa corpórea). Dependendo do objetivo de cada projeto, ora foram submetidos a exame clínico, coleta de sangue para patologia clínica, marcação por microchip subcutâneo e soltura; ora seguiram para eutanásia por sobredose de cloridrato de lidocaína injetada no forame magno, de acordo com dose preconizada por Chatigny et al.(30), dentro das resoluções do Conselho Federal de Medicina Veterinária(31) e posteriormente das diretrizes do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA)(32). Procedimentos em amostra parcial foram autorizados pela CEUA-USP n°4387250118.
2.2. Necrópsias e procedimentos laboratoriais
Os achados de patologia clínica decorreram de esfregaços sanguíneos e avaliações citopatológicas por punção aspirativa/impressão de lesões externas, conforme Campbell(33). Os achados patológicos ocorreram essencialmente durante necrópsias, segundo técnicas de Pessier e Pinkerton(34), ou incidentalmente, durante avaliações clínicas/biométricas e dissecções para coleta de tecidos (taxonomia molecular e status reprodutivo), dieta e parasitas. Os órgãos e tecidos alterados foram macroscopicamente descritos e amostrados para avaliação histopatológica de acordo com Tadrous(35). As lesões granulomatosas foram coradas por Ziehl-Neelsen (ZN) e Wade-Fite (WF) de acordo com Azulay & Andrade(35) e Greenwood & Fox(37). Depois de examinados e terem os dados de interesse coletados, os indivíduos foram fixados em formaldeído 10%, conservados em etanol 70% e tombados na Coleção Herpetológica da Universidade Federal do Ceará (CHUFC).
2.3. Análise de dados
As alterações foram classificadas em infectoparasitária/inflamatórias, tóxicometabólicas, traumáticas e neoplásicas. Os dados foram dispostos em tabelas de contingência com a identificação dos indivíduos e respectivas espécies, as categorias de procedência (Capital, Região Metropolitana e Interior do Estado), o N amostrai e as categorias de alterações com suas frequências. As prevalências dos achados, classificações e sítios de ocorrência foram expressos em porcentagem. Um teste de proporções comparou as prevalências dos principais achados entre as categorias de procedência, supondo prevalência mais baixas em locais menos antropizados. As análises estatísticas e os mapas foram produzidos no software R v. 4.2.2 (38).
3. Resultados
3.1. Espécimes incluídos e procedências
De 2010 a 2022, foram examinados 44 espécimes de anuros, distribuídos em 13 espécies (Tabela 1), procedentes de 13 localidades (Figura 1). Seis desses 44 foram excluídos por terem sido apresentados em conferências científicas. A amostra final conteve 38 espécimes.
Achados patológicos e incidentais em anuros no estado do Ceará. Espécies e tamanho de amostra por localidade
Achados patológicos e incidentais em anuros no estado do Ceará. Procedência dos indivíduos examinados
Por categoria de localidade, foram examinados sete indivíduos da capital Fortaleza; 13 da região metropolitana e 18 do interior do estado.
3.2. Achados patológicos e etiologia
Os achados patológicos segundo classificação e sítio de localização estão apresentados na Tabela 2.
Achados patológicos e incidentais em anuros no estado do Ceará. Contagem e distribuição das lesões observadas
Mais de 60% (22/38) dos diagnósticos decorreram de necropsia, seguida de avaliação histopatológica. Os demais compreenderam apenas a necropsia (10/38), acompanhamento clínico com posterior necropsia e histopatológico (2/38), apenas patologia clínica (2/38) e apenas observação clínica (2/38). Dentre as avaliações histopatológicas, 15/22 tiveram todos os órgãos celomáticos avaliados, enquanto no restante somente foi examinado o órgão com a lesão de interesse. Mais de 70,0% (27/38) foram achados únicos, seguidos de 11 /38 com achados múltiplos (dois a quatro) em diferentes órgãos. Cerca de 45,5% (5/11) de achados múltiplos podem ter decorrido da mesma etiologia, tóxica ou infectoparasitária.
Dentre as lesões observadas, 71% (27/38) apontavam para fisiopatologia inflamatória, provavelmente de etiologia infectoparasitária. Dessas, 40,7% (11/27) foram classificadas como alterações sistêmicas, por envolverem mais de um órgão simultaneamente ou alterações sanguíneas. Embora não tenha sido possível confirmar a principal etiologia ligada às alterações observadas, foram observadas 10/27 infecções parasitárias, com agente intralesional, 5/27 possíveis causas bacterianas, e 5/27 possíveis causas virais, e 5/27 agentes inconclusivos. Em 4/27 foram detectados indícios de mais de uma etiologia. Os achados estão apresentados na Figura 2.
Achados patológicos e incidentais macro e microscópicos em anuros do Ceará. (A) P. diplolister, dermatite parasitária multifocal (cabeças de seta) devido à ácaros Trombiculidae (topright, 10% NaOH). (B) R. diptycha, pneumonia parasitária com Nematoda intralesional (Rhabdias sp., HE, 100x). (C) L vastus, hepatite cística multifocal (HE, 100x), com Acanthocephala intralesional (topright, HE, 400x), e proliferação difusa de melanomacrófagos. (D) L macrosternum, esplenite granulomatosa multifocal, por merontes de Haemogregarinidae (arrowhead, HE, 10OOx). (E) P. relictus, miosite cística hemorrágica focal submandibular esquerda (seta) com Nematoda intralesional (canto inferior direito). (F) L. macrosternum, inclusões eosinofílicas intraeritrocitárias, compatíveis com FEV (Panótico, 400x). (G) L macrosternum, inclusões intracitoplasmáticas anfofílicas (cabeças de seta) em células tubulorrenais degeneradas, sugerindo infecção por Ranavirus (HE, 400x). (H) L macrosternum, hepatite granulomatosa multifocal, contend macrófagos e melanomatrófagos contendo partículas fagocitadas (WF, 40x), com estruturas tipo granuloma coradas difusamente em magenta (canto superior esquerdo, WF, 1000x). (I) L vastus, catarata madura bilateral (seta), com degeneração moderada das fibras secundárias da lente (canto superior esquerdo, HE, 40x), sugestivo de glóbulos Morganianos nas fibras primárias da lente (canto superior direito, HE, 1000x). (J) P. cuvieri, fígado difusamente aumentado e mineralizado (canto superior esquerdo), calcinose/silicose hepática difusa, mostrado hepatócitos difusamente degenerados e células de Kupffer balonizadas contendo partículas acastanhadas (HE, 400x). (K) L fuscus, nódulo subcutâneo na região anteorbital direita (canto superior direito) classificado com um fibrolipoma focal (HE, 40x). (L) B. raniceps, carcinoma hepatocelular (HE, 40x), tipo trabecular com cinco a dez células de altura, contendo pelo menos dois Physaloptera sp. Nematoda (não mostrados); hepatócitos pleomórficos, com relação núcleo: citoplasma aumentada, vacuolizações esporádicas (cabeça de seta) e células binucleadas (asterisco), e padrão de distribuição de cromatina irregular de periférica fina até grosseira (HE, 1000x).
Nas infecções parasitárias (Figura 2A B C D E), foram observadas dermatite parasitária multifocal leve por Trombiculidae (1/10); pneumonia parasitária granulocítica multifocal leve subaguda com Nematoda intralesional (Rhabdias sp.) (1/10); hepatite cística multifocal moderada com Acanthocephala intralesional (1 /10); esplenite granulomatosa multifocal crónica leve por merontes de Haemogregarinidae (2/10); gastrite subserosa cística multifocal moderada crónica por larvas de Acanthocephala (Centrorrynchus sp.) (1/10), e miosites celomáticas murais/cavitárias císticas piogranulomatosas ou hemorrágicas focais com Nematoda intralesional (2/10), submandibular esquerda (1/10) e femoral ventral esquerda (1/10), além de um neoplasma com Nematoda intralesional, que será discutido em detalhes mais adiante. Um indivíduo com nefrite parasitária cística intersticial multifocal crónica moderada com Nematodas intralesionais também apresentou granulomas específicos, sendo contabilizado nas etiologias bacterianas (comentado a seguir).
Dentre as 5/27 lesões com prováveis etiologias virais, 1/4 indivíduos, sem sinais clínicos detectáveis, apresentou inclusões intraeritrocitárias basofílicas ao esfregaço sanguíneo, compatíveis com Frog Erythrocytic Virus (FEV, Iridoviridae, Figura 2F). Os demais achados (4/5) compreenderam inclusões intracitoplasmáticas anfofílicas nos tecidos (Figura 2G), sugerindo Ranavirus. Dentre as prováveis etiologias bacterianas, os achados mais frequentes foram hepatites (3/5), esplenites (2/5) e nefrites (2/5) granulomatosas. Os granulomas se apresentaram multifocals a coalescentes, capsulados, multiloculares, medindo 30 a 550μm de diâmetro, contendo macrófagos e melanomacrófagos com material fagocitado, mas inconclusivos às colorações de ZN e WF, com coloração magenta difusa no interior dos granulomas sem, no entanto, mostrar bacilos ou glóbulos bacilares individualmente corados (Figura 2H). Além disso, um indivíduo com nódulos cutâneos apresentou inflamação piogranulomatosa ao diagnóstico citológico, revelando macrófagos espumosos com material bacilar negativo no citoplasma, sugestivo de micobacteriose cutânea. Por fim, 1/27 apresentaram blefarite fibrosante com cataratas maduras, descritas macroscopicamente, supondo-se ser consequência de uma doença infecciosa, provavelmente de etiologia viral.
A prevalência global de etiologias infectoparasitárias/inflamatórias variou de 61,5 (região metropolitana) a 77,7% (interior); entretanto, o teste de proporções não apontou diferença significativa entre as categorias de procedências dos espécimes (X2 = 0.15124, gl= 2, p = 0.9272). Aproximadamente 8% (3/38) dos diagnósticos foram classificados como tóxicometabólicos e incluíram calcinose e silicose hepática difusas marcantes (Figura 2J). Outros 8% (3/38) compreenderam lesões traumáticas, como amputações de membros e/ou dígitos (2/3), luxação de quadril (1/3), e erosões ou ulcerações cutâneas (1 /3). Além disso, outras duas lesões tegumentares fibrinonecróticas em região dorsal foram registradas, porém estavam associadas com alterações internas que indicaram possível doença infecciosa sistêmica. Aproximadamente 5% (2/38) incluíram neoplasias, sendo um deles fibrolipoma focal em região supra-orbital direita, e um carcinoma hepatocelular moderadamente diferenciado, com pelo menos dois cistos de Physaloptera sp. intralesionais (Figura 2K-L). Por fim, outros 13% (5/38) foram lesões oculares agrupadas como "não classificadas". Essas incluíram catarata bilateral (3/5, Figurai I), exoftalmia unilateral (1/5) e possível descolamento de retina unilateral (1/5), que podem ter etiologias senescência, infecciosas, traumáticas, neoplásicas ou tóxico-metabólicas.
4. Discussão
Ao todo foram registrados achados histopatológicos em 13 espécies de anfíbios anuros provenientes de 13 diferentes localidades do estado do Ceará. As espécies amostradas fazem parte do pool regional de espécies do estado(39) e ocorrem em diferentes unidades fitoecológicas, tais como Caatinga, Brejos-de-Altitude e Matas de Tabuleiro, o que as tornam sujeitas à diferentes pressões ambientais(40,41,42,43). A espécie mais abundante da amostra foi L. macrostemum (n=8), amplamente distribuída pela América do Sul(44), sendo encontrada em diferentes habitats ao longo da sua distribuição, incluindo aqueles com elevado nível de antropização(45). Recentemente, esta espécie foi avaliada como bioindicadora de contaminação química por metais pesados em uma região de agrossistemas no estado do Ceará, encontrando uma probabilidade significativa de ocorrência de alterações endócrinas e linfoides na amostra examinada (46,47).
As lesões observadas neste trabalho resultaram de diferentes processos patológicos, que sugeriram etiologias específicas. Em relação às doenças infecciosas virais e bacterianas, a não disponibilidade de laboratórios microbiológicos específicos foi um fator limitante; entretanto, os marcadores histopatológicos alertaram para a necessidade de monitoramento e implementação de projetos de pesquisa com parcerias visando conclusões diagnosticas.
Sobre os achados parasitários apresentados, sabe-se que dermatomiosite granulomatosa por ácaros Trombiculidae em anuros foi documentada em uma espécie nativa ameaçada na floresta litorânea do Chile central. Frequência de infecção de 70% (35/50) foi observada, com larvas encistadas predominantemente no stratum spongiosum da derme ventral e dorsal, e na musculatura dos membros posteriores, sem, no entanto, haver conclusão quanto aos efeitos negativos da carga parasitária no fitness dos hospedeiros(48). Diferentes helmintos podem ser encontrados em intestinos de vertebrados adultos, mas quando em fase larval, Cestodas podem provocar hemorragia e reação inflamatória, enquanto Nematodas podem se encistar em cavidade visceral(49) ou musculatura(50). Em geral, helmintos encistados correspondem a fases larvais infectantes em hospedeiros acidentais ou paratênicos(51,52,53). Cistos de Physalopteridae em estômagos com mínima reação inflamatória já foram relatados(54). A infecção de sistema respiratório por Rhabdias spp. pode estar associada com pneumonia supurativa, infecção bacteriana secundária e necrosed redução de performance, dispersão, forrageamento e evitação de predadores(55,57). Por outro lado, as miosites apresentaram hemorragia e infiltrado granulocítico leves, hipotrofia muscular compressiva e formação de edema cavitário, com larvas de Ascarididae encistadas em parede celomática.
Considerando Acanthocephala, há pouca informação sobre patologia associada em vertebrados ectotérmicos, exceto pelos danos erosivos a órgãos e tecidos em outros ectotérmicos e espécies experimentais(58,59). Anfíbios anuros são infectados por muitos parasitas ao longo de suas vidas(50), especialmente em estágios larvais, provavelmente devido às suas posições críticas nas cadeias alimentares ecossistêmicas(51). Os parasitas interferem no fitness individual, capacidades de forrageamento e reprodução, aumentando o impacto de doenças como a quitridiomicose e contribuindo para o declínio das populações de várias espécies (56,57,58,59,60,61,62) QS três espécimes de A maranguapensis, espécie local criticamente ameaçada, aqui examinados, sofriam os efeitos da miosite mural e cavitária por larvas de Nematoda. Além do exposto, os danos à espécie são ainda mais preocupantes devido ao seu tamanho corporal reduzido, no qual os parasitas podem ocupar mais de 50% do volume corporal ou cavitário, potencializando ainda mais os efeitos negativos ao desempenho físico e sobrevivência dos indivíduos afetados e contribuindo para aumentar a velocidade de redução de suas populações.
Há relativamente poucas doenças virais descritas e reportadas em anfíbios. Ranavirus (Iridoviridae) são patógenos emergentes, associados com eventos de mortalidade em massa tanto em indivíduos selvagens quanto em cativeiro(63). A Organização Mundial de Saúde Animal incluiu os Ranavirus na lista de doenças de notificação obrigatória, devido à sua contribuição ao crescente declínio de populações de anfíbios ao redor do mundo(64). Os surtos de mortalidade aguda acometem principalmente larvas e metamorfos, que apresentam clinicamente letargia, fraqueza, natação errática, anorexia, alterações tegumentares, edema e hemorragias externas; entretanto, dependendo da imunocompetência individual e da virulência do agente, adultos também podem ser acometidos, apresentando sinais semelhantes ou mais brandos(65). O mecanismo de ação dos Ranavirus é a invasão preferencial de células endoteliais e morte celular, por inibição do DNA, RNA e síntese proteica(66). Os achados patológicos são amplamente descritos e incluem hemorragias difusas e necrose tecidual, especialmente em fígado, baço e rins (incluindo seus componentes hematopoiéticos e linfoides), e ulcerações cutâneas(65).
As inclusões intracitoplasmáticas basofílicas ou anfofílicas são altamente sugestivas de infecção por Ranavirus; contudo, podem ser de difícil visualização nas amostras de tecido necrosado ao exame histopatológico convencional(65). Os achados deste trabalho sugeriram infecção por Ranavirus e levantam a necessidade urgente da realização de inquérito epizootiológico com métodos padrão-ouro para o diagnóstico definitivo. Um caso recente (67) descreveu um L vastus macho adulto de uma reserva urbana da cidade de Fortaleza mostrando múltiplos tecidos necrosados com inclusões anfofílicas intracitoplasmáticas em hepatócitos, esplenócitos, e células tubulares renais muito sugestivas(65) de infecção crónica por Ranavirus. Os 5/27 casos com diagnóstico etiológico inconclusivos vieram da reserva de Aiuaba o mostraram lesões inflamatórias e vasculares similares: fígados com moderada à difusa hiperplasia de melanomacrófagos, múltiplos sinusoides e veias centrais moderadamente congestas, leve à moderada balonização multifocal, hematopoiese multifocal moderada; esplenite granulomatosa multifocal moderada à marcante, com possíveis reflexos hipertensivos causando hepatopatias e nefropatias congestivas. Um dos cinco indivíduos apresentou linfócitos difusamente apoptóticos, juntamente com as alterações hepáticas e esplénicas já citadas. Devido à morfologia e à frequência dentro da amostra de uma mesma localidade, tais achados sugerem infecção viral(65), embora inclusões intracelulares não tenham sido observadas. A micobacteriose em anfíbios tem registros consistentes na literatura, com uma frequência de 0,76% a 100% de detecção em indivíduos com lesões granulomatosas cutâneas ou viscerais evidenciadas macroscopicamente(23,68,69). Em relação aos granulomas examinados, eventuais macrófagos epitelioides e linfócitos foram observados, mas não células gigantes.
A morfologia geral era compatível com granulomas imunes "em fase de cura", caracterizada por material granuloso, capsulado por tecido fibroso, com caseificação variável e eventual calcificação ao centro. Ackerman(70) ressalta que as micobactérias e seus antígenos são esparsos no interior dos granulomas e que raramente são marcadas em ZN clássico ou modificado. Além disso, podem também perder as características tintoriais da parede bacteriana em infecções persistentes ou latentes(71), e o processamento histológico (fixação em formaldeído e diafanização em xilol) reduz a sensibilidade da coloração, corando apenas 3 a 10% dos bacilos nas amostras(72). Especula-se se a marcação magenta difusa dentro dos granulomas corresponderia à expansão de antígenos micobacterianos em macrófagos e tecido necrosado, uma vez que tal achado foi observado e quantificado experimentalmente(73).
Considerando a morfologia semelhante dos granulomas nos demais indivíduos e o histórico epidemiológico de M. gordonae detectado por PCR em anuros do sul do Ceará(23), e resultado negativo de várias amostras para coloração de PAS e Grocott (excluindo-se granulomas fúngicos), presume-se que esses cinco casos também tenham diagnóstico etiológico de micobacteriose visceral. A micobacteriose visceral em anfíbios vem sendo relatada há mais de um século na Europa(74,75,76,77), e há várias décadas no Brasil(78,79,80); além disso, a morfologia já descrita tem sido concordante os atuais achados. As micobactérias atípicas nem sempre têm potencial zoonótico conhecido. A espécie M. gordonae, já detectada em anfíbios do Ceará(23), e dentre várias outras micobactérias não-tuberculosas, costuma ser considerada uma bactéria ubíqua não-patogênica; entretanto, existem registros de causar infecção oportunista em humanos imunocomprometidos(81). Em animais colonizados, o aumento do estresse pelas condições adversas no cativeiro pode produzir surtos com lesões exuberantes(82). Por outro lado, um caso anteriormente descrito de granulomatose multifocal marcante, com bacilos álcool-ácido positivos para ZN provavelmente indicaram uma infecção por bactéria do grupo M. tuberculosis (Braga, dados não publicados), o que é considerado um achado zoonótico preocupante.
Interação com predadores é considerada a maior causa de lesões traumáticas em anuros(83,84) . Pesquisadores no Panamá descobriram que a lesão mais frequente em uma amostra de Dendrobates auratus foi a amputação de dígitos, registrada em 89,9% (532/592), e com menor frequência fratura e amputação de membros, e enucleação ocular(85). Os presentes dados mostraram alterações músculo-esqueléticas em indivíduos depositados na CHUFC, com amputação de mão, pé e perna completa, deixando extremidades ósseas de rádio-ulna e tíbia expostas com tecido moles adjacentes cicatrizados. Acredita-se que tais alterações possam ter deixado os indivíduos em questão mais suscetíveis à captura manual nas expedições de pesquisa relacionadas.
Animais ectotérmicos terrestres podem desenvolver distúrbios metabólicos que culminem com a mineralização de articulações, órgãos e tecidos moles por deposição de cristais nitrogenados (gota úrica) ou de cálcio (pseudogota ou calcinose)(86) . Raros relatos estão disponíveis em ectotérmicos terrestres silvestres, exceto em tartarugas marinhas(51). Geralmente tais achados estão associados a desequilíbrios dietéticos em animais de cativeiro. Calcinosis circunscripta foi observada em larvas de Lithobates (sin. Rana) catesbeianus em áreas próximas a estação de tratamento de esgotos (87). Em achados de necropsia sem histórico clínico, se faz necessário uso de exames complementares para fazer o diagnóstico diferencial entre a gota e a calcinose. Previamente apresentados em conferência científica, 3/4 registros de calcinose hepática foram relatados (Braga, dados não publicados), utilizando microscopia eletrônica e polarizada para confirmar o diagnóstico de calcinose/silicose, e a fisiopatologia sugerida foi ingestão crónica de aditivos agrícolas à base de silicatos, produzindo hipomagnesemia e hipercalcemia, levando à insuficiência renal crónica, com deposição de cálcio em órgãos e tecidos moles (Braga, dados não publicados). Mais um caso semelhante e oriundo do mesmo local foi incluído no presente estudo.
Tumores de crescimento espontâneo têm sido relatados em anfíbios desde 1868(88). Em revisão recente, foram listados 24 relatos de tumores benignos e 26 de malignos distribuídos em 28 espécies de anfíbios (18 anuros e 10 caudados), dentre os quais os cromatoforomas (18%), os linfomas e leucemias (12%) e os papilomas (10%)(89). Vinte e quatro por cento dos casos levantados foram tratados com cirurgia e tiveram sobrevida de 0,8 a 46 meses. Dois casos de lipomas foram relatados, que se diferenciam do fibrolipoma descrito neste trabalho pela ausência das bandas fibrosas que envolvem o nódulo de tecido adiposo. Nenhum hepatocarcinoma espontâneo foi listado, o que indica que este é um neoplasma raro ou nunca antes registrado em anfíbios; contudo, a injeção subcutânea experimental de dietilestilbestrol em Rana temporaria produziu 7/38 casos de neoplasia hematopoiética e 2/38 de hepatocarcinoma indiferenciado(90), o que pode indicar ação de xenobiótico ambiental como gatilho do caso aqui observado. Os Nematodas encistados no interior do tumor aqui observado podem estar relacionados com inflamação crónica e consequente carcinogênese. Já é estabelecida a participação de helmintos Trematodas na carcinogênese hepática(91); quanto aos Nematodas, foi proposto recentemente que o fato desses helmintos produzirem TGF-β para modular a resposta imune do hospedeiro a favor de sua sobrevivência pode favorecer também a proliferação de células neoplásicas, através da regulação negativa da imunidade antitumoral(92).
A alteração ocular unilateral observada em um L vastus não foi classificada, devido à incerteza de sua etiologia. Inicialmente, foi classificada como "traumática"; no entanto, oculopatias infecciosas em animais podem cursar com descolamento e atrofia da retina, atribuídas a infecções virais(93). Nos EUA, um espécime metamorfo silvestre de L catesbeianus apresentou má formação ocular unilateral, com redução de volume do globo, fibrose da esclerótica e granulomas, que foram associados a partículas virais de Ranavirus (FV-3)(94). As retinopatias são raras, embora haja relatos pontuais de descolamento de retina por necrose aguda associada à dermatossepticemia por bactérias gram-negativas em indivíduos ex situ (95,96) Em humanos, retinopatias virais são bem descritas, com fisiopatologia derivada de danos teciduais diretos e por deposição de imunocomplexos por antígenos de Herpesvirus e Rubivirus(97). Tais mecanismos também podem ser atribuídos a Ranavirus e seus congéneres, cuja replicação tem preferência por células epiteliais, endoteliais e linfoides, causando vasculites fibrinoides potencialmente em qualquer órgão(98). Incluindo membros da família Iridoviridae, várias espécies de vírus podem produzir deposição de imunocomplexos, agravando a morbidade(99). Além disso, podem também causar autoimunidade retinal(100).
5. Conclusão
A necropsia demonstrou ser uma ferramenta fundamental na vigilância em saúde de anuros no Ceará. Aavaliaçãopós-morte foi capaz de identificar diversas doenças em espécimes sem sinais clínicos externos. A análise de indivíduos de coleções científicas foi fundamental uma vez que são um repositório de informações sanitárias da fauna local. Lesões sugestivas de infecções por Ranavirus foram detectadas, e diagnóstico etiológico complementar se faz necessário. Como possíveis etiologias, Micobactérias atípicas são preocupantes devido ao potencial zoonótico ainda desconhecido. Lesões parasitárias acentuadas foram observadas e preocupam devido a possíveis efeitos em capacidade fisiológica individual e ecológica. Esses achados incluem o Ceará no mapa de distribuição de importantes doenças da anurofauna que precisam ser monitoradas.
Agradecimentos
Nós gostaríamos de agradecer à Dra Diva Maria Borges-Nojosa e Dr. Paulo Cascon (UFC); Dr. Daniel Viana de Araújo (Laboratório Pathovet); estudantes de pós-graduação do PPGERN e PPGSis-UFC, e toda a equipe do NUROF-UFC. Também gostaríamos de agradecer à Coordenação de Aperfeiçoamento do Pessoal de Nível Superior (CAPES - Código Financeiro n°001) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelos 12 anos de financiamento aos nossos projetos de pesquisa (Processos n° 304929/2012-3; 401800/2013-0; 402241/2016-9; 305988/2018-2: 307722/2021-0).
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