Determinação da diversidade microbiana na conjuntiva ocular de cães saudáveis pelo sequenciamento completo do DNAResumo
A conjuntiva desempenha papel fundamental na saúde e imunidade ocular e atua como uma barreira à entrada de microrganismos. As infecções conjuntivais são comuns em cães e resultam tanto da invasão de microrganismos patogênicos quanto do crescimento descontrolado da microbiota existente. A maior parte dos dados existentes provém de estudos baseados em métodos de cultura tradicionais. Esses relatos apontam para o predomínio de bactérias gram-positivas, principalmente Staphylococcus spp. O presente estudo analisou a comunidade microbiana presente na conjuntiva ocular de uma população heterogênea de cães sem distúrbios oftalmológicos por sequenciamento de DNA. Após exame oftálmico minucioso, foram coletados suabe conjuntivais de ambos os olhos de 30 cães. Após processamento e extração de ácidos nucleicos, o pool de amostras foi submetido ao sequenciamento shotgun de DNA por meio da plataforma Illumina e analisado no servidor Metagenomic Rapid Annotations using Subsystems Technology (MG-RAST). Foi identificada uma predominância do filo Proteobacteria e dos gêneros Ralstonia e Burkholderia juntamente com uma minoria de fungos, enquanto vírus não foram encontrados. O sequenciamento do DNA microbiano trouxe novos dados sobre o assunto, revelando a presença de organismos não cultiváveis até então desconhecidos como parte do microbioma ocular.
Abstract
The conjunctiva plays an essential role in eye health and immunity and acts as a barrier to the entry of microorganisms. Conjunctival infections are common in dogs and result from both the invasion of pathogenic microorganisms and the uncontrolled growth of the existing microbiota. Most of the existing data come from studies based on traditional culture methods. These reports indicate the predominance of gram-positive bacteria, especially Staphylococcus spp. In the present study, we analyzed the microbiota present on the conjunctival surface from a heterogeneous dog population without ophthalmological disorders using DNA sequencing. After a thorough ophthalmological examination, conjunctival swabs were collected from both eyes of 30 dogs. After processing and nucleic acid extraction, the sample pool was subjected to shotgun DNA sequencing through the Illumina platform and analyzed via the Metagenomic Rapid Annotations using Subsystems Technology (MGRAST) server. A predominance of the phylum Proteobacteria and the genera Ralstonia and Burkholderia were identified along with a minority of fungi, whereas viruses were not found. Microbial DNA sequencing has provided new data on this subject, revealing the presence of noncultivable organisms that were previously unknown as part of the ocular microbiome.
Keywords:
bacteria; ophthalmology; eye; microbiome; metagenomics.
1. Introdução
A conjuntiva desempenha um papel essencial na função lacrimal, na proteção imunológica do olho, na mobilidade ocular e na regeneração da córnea e atua como barreira à entrada de microrganismos patogênicos. (1,2) A inflamação conjuntival é um dos distúrbios oculares mais comumente diagnosticados na prática veterinária; ela ocorre raramente de forma isolada e é mais comumente secundária a outras doenças oculares inflamatórias, como ceratite ulcerativa, deficiência na produção lacrimal e glaucoma. Em alguns casos, a determinação da etiologia é desafiadora. (3) As infecções podem resultar tanto da invasão de um microrganismo patogênico quanto do crescimento descontrolado da microbiota existente devido à baixa imunidade. (4)
A conjuntivite infecciosa em cães pode ter origem bacteriana, fúngica, viral ou parasitária. As bactérias que já foram descritas em casos clínicos incluem Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Bacillus spp., Enterobacter spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp. e Proteus spp. (5,6,7) Além disso, os fungos que foram descritos incluem Blastomyces dermatitidis e Curvularia spp. (8, 9) Entre os vírus que foram previamente relatados, o herpesvírus canino (CHV-1), o adenovírus canino (CAV-1 e CAV-2) e o vírus da cinomose canina (CDV) são as principais espécies identificadas em cães. (10,11,12)
No que diz respeito à microbiota conjuntival de cães saudáveis, até o momento nenhuma espécie viral foi descrita nos estudos disponíveis na literatura. Em contrapartida, a microbiota bacteriana parece ser predominantemente composta por Staphylococcus spp. de acordo com métodos tradicionais de cultivo. (1,7,14,15,16) Além disso, os fungos Alternaria spp., Cladosporium spp., Penicillium spp., Aspergillus spp. e espécies de leveduras Candida spp. foram detectados na conjuntiva de cães saudáveis usando métodos de cultura micológica, sendo estes considerados como microbiota transitória. (16,17)
Com o advento das técnicas de sequenciamento de última geração (NGS), o conhecimento a respeito da microbiota não cultivável de diferentes sítios de animais saudáveis tem fornecido informações importantes e mais extensas do que as anteriormente conhecidas usando métodos dependentes de cultura. Até o momento, apenas um estudo descreveu a microbiota ocular de cães por meio de NGS, o qual foi especificamente realizado usando sequenciamento de amplicons do gene 16S rDNA. Embora os autores tenham demonstrado que Firmicutes é o filo mais prevalente, ao nível do gênero houve uma predominância de Bifidobacterium spp., uma bactéria que não havia sido descrita em pesquisas. Bifidobacterium spp. foi detectado em 92,8% das amostras e representou 9,1% de todas as reads. (18)
Considerando a importância da conjuntiva na saúde ocular e seu frequente envolvimento em condições infecciosas, é extremamente importante atualizar os dados existentes sobre a microbiota ocular de cães saudáveis por meio de técnicas moleculares mais refinadas, devido ao fato de estarem disponíveis atualmente. O objetivo inicial do presente estudo foi determinar se vírus habitam a conjuntiva ocular de cães saudáveis; em caso positivo, tínhamos como objetivo identificar esses vírus. Além disso, objetivamos analisar a microbiota conjuntival presente nesse local.
2. Materiais e Métodos
A metodologia aplicada neste estudo foi aprovada pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), sob o protocolo 35271. Este estudo também foi conduzido de acordo com as diretrizes da Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) sobre o uso de animais em pesquisas oftálmicas.
2.1 Exame oftálmico e coleta de amostras
A primeira etapa do estudo foi realizada no Hospital de Clínicas Veterinárias da UFRGS em Porto Alegre, RS, Brasil, e incluiu ambos os olhos de 30 cães saudáveis, de diferentes sexos, raças e idades, domiciliados em diferentes ambientes. A descrição da população amostrada está disponível na Tabela 1.
Todos os animais foram submetidos à avaliação oftalmológica realizada por profissional oftalmologista antes da coleta das amostras, incluindo teste lacrimal de Schirmer (Schirmer Lacrimal Test, Ophthalmos, São Paulo, Brasil), biomicroscopia com lâmpada de fenda (SL15, Kowa Company, Nagoya, Japão), teste de fluoresceína (fluoresceína sódica 1%, Ophthalmos, São Paulo, Brasil) e tonometria de rebote (Tonovet®, Tiolat, Helsinki, Finlândia). Os critérios de exclusão utilizados anteriormente por Ledbetter foram utilizados no presente estudo. (12) Foi constatada a ausência de doenças oculares. Após essa avaliação, uma gota de colírio anestésico (cloridrato de tetracaína 1% e cloridrato de fenilefrina 0,1%, Allergan, São Paulo, Brasil) foi instilada na superfície ocular. Sob contenção manual gentil, as amostras de conjuntiva foram coletadas com um suabe estéril (Absorve®, Jiangsu Suyun Medical Materials, Lianyungang, China) que tocou a conjuntiva palpebral inferior e superior e a conjuntiva bulbar sem entrar em contato com a superfície externa das pálpebras.
Os suabes foram colocados em microtubos livres de DNase/RNase. No máximo duas horas após a coleta, eles foram levados ao laboratório. Dentro de uma cabine de biossegurança, cada amostra foi diluída em 250 µl de água ultrapura com 250 µl de tampão de estabilização de DNA AS (Qiagen, Germantown, EUA) e após foram mantidas a -80 °C até o processamento.
2.2 Processamento das amostras e sequenciamento dos ácidos nucleicos
Os procedimentos de extração de ácidos nucleicos foram realizados com cuidado para reduzir a contaminação cruzada. Todas as amostras foram descongeladas à temperatura ambiente. Após homogeneização em vortex, formou-se um pool com 200 µl de cada amostra. Este conjunto foi filtrado através de um filtro de seringa estéril de 0,22 µm (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha) para remover impurezas e debris celulares. Em seguida, o pool foi ultracentrifugado em colchão de sacarose 25% a 4°C (27.000 rpm) por duas horas. O pellet resultante foi tratado com enzimas DNAse (2 U) e RNAse (5 µl, 20 mg/ml) (19). Posteriormente, a extração de DNA foi realizada com o protocolo fenol/clorofórmio e a extração de RNA foi realizada com o reagente TRIzol® LS (Life Technologies, Carlsbad, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os ácidos nucleicos foram posteriormente enriquecidos com kits de amplificação de DNA e RNA (Sigma Aldrich, Saint Louis, EUA). Os ácidos nucleicos foram então submetidos à purificação utilizando o PureLink® PCR Purification Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA). Sua qualidade e quantidade foram avaliadas por meio de espectrofotômetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) e fluorômetro Qubit (Invitrogen, Carlsbad, EUA), respectivamente.
Uma biblioteca metagenômica shotgun de DNA foi preparada com 50 ng de ácidos nucleicos purificados usando um kit de preparação de DNA Nextera (Illumina, San Diego, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O sequenciamento da biblioteca foi realizado com um sequenciador Illumina® (Illumina, San Diego, EUA) utilizando a plataforma MiSeq v2 300 (2x150 ciclos).
O sequenciamento gerou um total de 371.504 reads de alta qualidade. Essas reads foram inicialmente recortadas com o aplicativo FASTQ e depois submetidas a uma ferramenta de montagem de novo assembly usando o programa SPAdes versão 3.9. Os 8.593 contigs gerados foram comparados com o banco de dados de vírus GenBank através do Blast2GO versão 5.2. Posteriormente, com auxílio do Geneious Prime versão 9.1.1 e da ferramenta BLASTx, os resultados foram confirmados manualmente. Durante este processo, apenas sequências de DNA semelhantes a bacteriófagos foram encontradas, mas nenhum outro vírus foi identificado. Porém, quando as leituras foram analisadas no servidor MG-RAST 4.0.3 (//www.mg-rast.org), um grande número de microrganismos foi identificado e, portanto, considerado na análise. Os mesmos contigs formados via SPAdes foram submetidos a essa análise e a plataforma conseguiu reconhecer todas as sequências, totalizando 5.228.105 pares de bases (pb), com média de 608 pb por sequência. A distribuição taxonômica foi determinada com base no algoritmo do menor ancestral comum (LCA).
3. Resultados
De acordo com a análise do MG-RAST, a maioria das sequências detectadas pertenciam ao domínio Bacteria, seguido pelos domínios Eukaryota e Archaea. Algumas sequências não foram identificadas e uma minoria correspondia ao domínio dos vírus (bacteriófagos), conforme mostra a Figura 1.
Distribuição taxonômica na conjuntiva ocular de cães saudáveis. Os domínios foram previstos usando o servidor MG-RAST. A abundância de domínios está relacionada ao número total de contigs analisados. Os valores percentuais de abundância são indicados.
Uma análise de rarefação foi realizada para estimar a diversidade microbiológica identificada no conjunto de sequências. Essa curva tornou-se estável ao atingir um valor próximo a 8.000 contigs, o que indica que a identificação de novos organismos é improvável após atingir esse patamar, mesmo que seja realizado um sequenciamento adicional (Figura 2). Portanto, a curva de rarefação mostrou que a profundidade do sequenciamento foi suficiente para identificar a diversidade microbiana da amostra.
A curva de rarefação mostra a profundidade do sequenciamento. A curva mostra a relação entre o número de espécies recuperadas (eixo x) e o número total de contigs analisados (eixo y).
Entre os bacteriófagos, o MG-RAST identificou apenas onze sequências, a maioria proveniente das bactérias presentes nesta análise, como Burkholderia spp., Ralstonia spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus spp. e Bacillus spp. (Tabela 2). No domínio Archaea, todas as sequências correspondem ao filo Euryarchaeota, mas nenhuma classificação adicional foi determinada.
No domínio Eukaryota, foram encontrados dois filos fúngicos (Basidiomycota e Ascomycota) e um filo Chordata, que inclui vertebrados. A Figura 3 ilustra essa classificação.
Composição do domínio Eukaryota detectado na conjuntiva ocular de cães saudáveis. Foram obtidos dados do servidor MG-RAST, incluindo o valor percentual de cada classificação. As porcentagens são relativas ao número total de contigs analisados através do servidor.
Dentro do domínio Bacteria, que representou 94,49% das sequências analisadas, os filos mais prevalentes foram Proteobacteria e Bacteroidetes, representando 97,4% do total de bactérias encontradas. Os outros filos presentes foram Actinobacteria, Firmicutes e Verrucomicrobia, entre outros. Quando esse domínio foi dividido em classes, Betaproteobacteria (86,73%), Alphaproteobacteria (7,47%), Gammaproteobacteria (2,24%), Sphingobacteria (0,96%) e Actinobacteria (0,87%) representaram 98,27% das sequências analisadas. Ao considerar a ordem taxonômica, 97,89% das sequências corresponderam a Burkholderiales (89,97%), Sphingomonadales (3,38%), Rhizobiales (2,57%), Sphingobacteriales (1,02%) e Pseudomonadales (0,95%). No nível de família, 96,98% das sequências pertenciam a Burkholderiaceae (90,32%), Sphingomonadaceae (2,80%), Bradyrhizobiaceae (1,67%), Comamonadaceae (1,12%) e Sphingobacteriaceae (1,07%). A Figura 4 demonstra essa classificação.
Composição da comunidade bacteriana na conjuntiva ocular de cães saudáveis (a) ao nível de filo, demonstrando a predominância do filo Proteobacteria; (b) ao nível de classe, em que é indicada Betaproteobacteria; (c) ao nível de ordem, onde predomina Burkholderiales, seguido de Sphingomonadales; e (d) ao nível de família, onde Burkholderiaceae é a mais representada.
A maior parte das sequências correspondeu aos gêneros Ralstonia (52,35%) e Burkholderia (39,58%), representando 91,93% do total. A Figura 5 mostra os cinquenta gêneros que o MG-RAST conseguiu identificar a partir das sequências analisadas. Este gráfico mostra apenas os que foram representados por mais de 10 sequências. Curiosamente, os gêneros Staphylococcus e Bacillus foram identificados em apenas cinco sequências cada, totalizando apenas 0,18% cada. Os nomes de todos os gêneros bacterianos encontrados na análise estão disponíveis na Figura 6.
Os gêneros bacterianos mais abundantes identificados na conjuntiva ocular de cães saudáveis. O eixo x mostra os gêneros mais prevalentes combinados nas amostras. O eixo y mostra a porcentagem de contigs para cada gênero identificado.
Composição de gêneros bacterianos da conjuntiva ocular de cães saudáveis. A análise foi realizada com o servidor MG-RAST, que identificou os 50 gêneros bacterianos mais prevalentes nas amostras analisadas.
4. Discussão
No presente estudo, nós investigamos a diversidade microbiana conjuntival de cães sem distúrbios oftalmológicos através de sequenciamento metagenômico de DNA (abordagem shotgun) e observamos predominância do filo Proteobacteria e dos gêneros Ralstonia e Burkholderia. Um estudo anterior em que foram sequenciados amplicons do gene da região hipervariável 16S rRNA V3-V4 mostrou predominância do filo Firmicutes, estando Proteobacteria entre os mais prevalentes na superfície ocular de cães. (18) Da mesma forma, Proteobacteria também é o filo mais comumente encontrado na conjuntiva de humanos saudáveis. (20,21,22) Esses microrganismos provavelmente interagem entre si e com o sistema imunológico do hospedeiro, permitindo vigilância constante do microambiente da superfície ocular. Estudos anteriores foram realizados para analisar a microbiota ocular de cães utilizando técnicas de cultivo microbiológico. (1,7,14,15,16) Diferentemente dos nossos achados, esses autores encontraram predomínio de Staphylococcus spp. No entanto, os dados dessas diferentes metodologias não podem ser comparados porque as análises por NGS são altamente sensíveis e podem identificar microrganismos que não são identificados nas análises convencionais de cultura. (23)
Existe uma variabilidade considerável nas espécies e na quantidade de bactérias que compõem a microbiota de um determinado local, a qual é influenciada pela localização geográfica, nutrição e clima. (24) Com o objetivo de alcançar ampla variabilidade, nosso estudo utilizou 30 cães de diferentes residências que eram alimentados de diferentes maneiras.
O objetivo inicial do presente estudo foi determinar se existiam vírus habitando a conjuntiva ocular de cães saudáveis; em caso positivo, nosso objetivo era determinar quais vírus estavam presentes. A metodologia baseou-se em outros estudos que também buscaram identificar o viroma de diversos locais a partir de amostras clínicas, como fezes, (25) soro, (26) órgãos (27) e secreções. (28) O tamanho das partículas virais dos vírus de interesse veterinário é extremamente variável, com variação média entre 17 e 300 nm de diâmetro. (29) O filtro de 0,22 µm é capaz de filtrar restos celulares e bactérias e permite a passagem de vírus, o que é uma etapa sugerida no processamento de amostras para detecção de viral. (26) Embora o método de processamento tenha sido baseado na literatura, apenas 11 sequências foram identificadas como bacteriófagos de Ralstonia spp., Burkholderia spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. e Sinorhizobium spp., mas nenhum outro vírus foi encontrado. Este resultado indica que os vírus podem não habitar a conjuntiva ocular de cães sem distúrbios oftalmológicos. Portanto, quando outros veterinários ou pesquisadores identificarem vírus em amostras de olhos doentes, deverão considerá-los como potenciais agentes patogênicos da condição clínica em questão.
Mesmo com uma potencial perda de bactérias através de um filtro de 0,22 µm, uma ampla gama de bactérias foi detectada e a curva de rarefação permaneceu estável. Destacamos que este cenário pode introduzir um viés nas sequências recuperadas. No entanto, como os metagenomas identificados foram semelhantes aos de análises anteriores de metagenoma ocular, podemos explorar os dados. Além disso, foi encontrado um número importante de organismos eucarióticos de diferentes tamanhos; acreditamos que isso se deva à lise da membrana plasmática gerada pela manipulação, que permite a passagem dos ácidos nucléicos pelo filtro. Devido ao fato da técnica utilizada detectar material genético e não células viáveis, foi possível recuperar uma ampla gama de bactérias, bem como algumas sequências de fungos. Portanto, as sequências de microrganismos mais abundantes (consistindo principalmente de bactérias) foram cuidadosamente analisadas.
Dentre os organismos eucarióticos, identificamos sequências de fungos dos filos Basidiomycota e Ascomycota. Em um estudo anterior, Suchodolski et al. (30) identificaram DNA fúngico em biópsias de intestino delgado de 64 cães saudáveis e 71 cães com enteropatias usando PCR. Todos os 51 filotipos identificados pertenciam aos filos Ascomycota (32 filotipos) ou Basidiomycota (19 filotipos). Vários anos depois, Foster et al. (31) determinaram o microbioma de fezes de 12 cães saudáveis e 7 cães com diarreia aguda através de NGS e os mesmos filos (Ascomycota e Basidiomycota) foram observados como os mais abundantes, além de serem encontrados em mais de 50% dos cães em ambos os grupos. Devido ao contato orofecal e ao hábito de cheirar e até mesmo ingerir material fecal, a presença de fungos entéricos na microbiota ocular de cães é justificável e esperada.
A microbiota ocular de cães tem sido objeto de diversos estudos utilizando técnicas tradicionais de cultura microbiológica nas últimas décadas. (1,14,32) Esses relatos indicam o predomínio de bactérias gram-positivas, principalmente Staphylococcus spp., pertencente ao filo Firmicutes. (1,7,15,32) Staphylococcus spp. também foi isolado da pele e pêlos de cães saudáveis e dermatopatas. (33,34) As pálpebras são estruturas oculares delimitadas internamente pela conjuntiva palpebral e externamente por pele e pelos finos. (1) Assim, Staphylococcus spp. pode estar presente na parte externa das pálpebras de cães com ou sem conjuntivite e blefarite. Além disso, a bactéria também está presente na pele humana saudável, inclusive na região das mãos. (35) Porém, no presente estudo, essa bactéria foi identificada em um número muito pequeno de sequências (0,18%), assim como foi observado em outros estudos de NGS, (18) o que pode ser explicado pelo extremo cuidado em evitar o toque nas pálpebras e nas margens palpebrais dos cães durante a coleta, bem como pela lavagem prévia das mãos, uso de luvas durante o procedimento de coleta e posterior manipulação das amostras em laboratório. Além disso, a alta detecção de Staphylococcus spp. em estudos anteriores com métodos de cultura tradicionais pode estar relacionada ao seu possível efeito inibitório sobre outras bactérias em cultura. (36)
O único estudo já realizado utilizando sequenciamento NGS para determinar o microbioma ocular de cães saudáveis, mas com método diferente do nosso, demonstrou predominância do filo Firmicutes. Contudo, o gênero mais prevalente foi Bifidobacterium spp., que pertence ao filo Actinobacteria. (18) Em nosso estudo foi identificado o filo Actinobacteria; no entanto, o filo Proteobacteria foi o mais prevalente, o que está de acordo com dados recentes sobre o microbioma ocular de outras espécies, como felinos, (37) equinos (9) e humanos. (20,21,22) Ralstonia spp. foi o gênero mais frequentemente observado em nossa análise (Figura 4). Ela consiste em uma Betaproteobacteria que habita o meio ambiente e é encontrada principalmente na água e no solo, com algumas espécies patogênicas oportunistas. (38) Hoffmann et al. (39) avaliaram o microbioma da pele de cães saudáveis e alérgicos, incluindo coleta da superfície ocular e de outros sítios mucosos, por meio de pirosequenciamento. O gênero Ralstonia foi o mais abundante nas amostras de cães saudáveis e compreendeu 35% do total de bactérias encontradas na conjuntiva ocular. A proporção de Ralstonia spp. encontrada em cães alérgicos foi significativamente menor do que em cães saudáveis. Estes autores concluíram que Ralstonia spp. originou-se do ambiente, dada a interação frequente dos cães com o ambiente externo. (39) Nosso estudo corrobora com esta consideração, pois os principais habitats da maioria dos cães amostrados eram quintais ou casas de jardim. Porém, considerando que esta foi a segunda identificação de Ralstonia spp. usando sequenciamento do metagenoma e que esta era a bactéria predominante na conjuntiva ocular, possivelmente não seja apenas uma bactéria ambiental transitória, mas também uma parte permanente da microbiota ocular de cães saudáveis. Um estudo recente com NGS em cavalos também demonstrou que a comunidade microbiana ocular era dominada pelo filo Proteobacteria e pelo gênero Ralstonia. (40)
No presente estudo, o gênero Burkholderia foi o segundo gênero mais comum na amostra, sendo responsável junto com Ralstonia spp. por quase 92% das sequências resultantes (Figura 4). Esta bactéria foi associada à melioidose ocular em humanos e felinos, (41,42) bem como a doenças sistêmicas em cães. (43) Apesar de o presente estudo não ter atingido o nível taxonômico das espécie, a observação de Burkholderia spp. na conjuntiva ocular de cães demanda mais pesquisas a fim de melhor esclarecer esse fenômeno.
Embora tenha tido ocorrência bem menor que os dois primeiros gêneros, Cupriavidus spp., que é uma bactéria da família Burkholderiaceae, foi o terceiro gênero mais frequente e foi encontrado em 1,79% das sequências (Figura 4). Houve relatos do isolamento de Cupriavidus spp. em diversos ambientes, incluindo solo e água, (44,45) bem como em humanos com doenças sistêmicas. (46)
Em nosso estudo, a presença de Sphingomonas spp., que é uma Alphaproteobacteria da família Sphingomonadaceae, foi verificada em 1,11% das sequências. Essa bactéria já foi isolada de amostras de ar e poeira, (47) bem como da microbiota da pele de cães. (48) O microbioma ocular humano já foi examinado através de NGS e Sphingomonas spp. foi identificada entre as bactérias mais prevalentes, representando 1% a 10% de todos os gêneros encontrados. (20,22) Recentemente, também foi identificada em uma abundância de 7,2% no microbioma ocular de cavalos saudáveis. (49) Todos esses resultados nos levam a acreditar que os resultados do presente estudo indicam uma colonização real da conjuntiva ocular de cães por Sphingomonas spp.
Até o momento, este é o primeiro estudo a identificar Pseudomonas spp. na conjuntiva ocular de cães saudáveis usando sequenciamento metagenômico de DNA (Figura 4). Esta bactéria foi identificada no saco conjuntival de cães saudáveis e cães com ceratite ulcerativa na China através de métodos de cultura bacteriana. (15) Pseudomonas spp. é essencialmente oportunista em casos de doenças oculares em cães, causando destruição tecidual e levando a blefarite, conjuntivite, ceratite, esclerite e endoftalmite, entre outras doenças. (6) Pseudomonas spp. também faz parte do microbioma do olho humano, o que foi confirmado via NGS. (21)
Uma limitação específica deste estudo foi a falta de diferenciação entre a microbiota residente e transitória encontrada na conjuntiva ocular canina. No entanto, ainda é difícil realizar a diferenciação de microrganismos residentes/transitórios em locais mucosos permanentemente expostos em contato direto com o ar. Embora possa existir microbiota transitória, a sua identificação é relevante, uma vez que os microrganismos transitórios podem tornar-se patogénicos dependendo das condições que encontram. Estudos anteriores também não conseguiram realizar essa diferenciação. (7,15,16,18) Novos estudos são necessários para melhor compreender a relação entre a microbiota conjuntival e os casos de doença clínica. Seria interessante replicar nossa metodologia utilizando amostras de cães com conjuntivite clínica.
5. Conclusão
Neste estudo, observamos principalmente Ralstonia spp., Burkholderia spp., Cupriavidus spp., Sphingomonas spp. e Pseudomonas spp. habitando a conjuntiva ocular de cães sem distúrbios oftalmológicos. Embora os fungos tenham sido identificados em baixas porcentagens, agentes virais eucarióticos não foram identificados; entretanto, foram encontradas algumas sequências relacionadas a bacteriófagos. Esses achados sugerem que essas bactérias podem compor a diversidade microbiana conjuntival, o que é relevante para a manutenção da saúde da superfície ocular. A abordagem shotgun de sequenciamento de DNA forneceu novos dados sobre este assunto, demonstrando assim a presença de bactérias até então desconhecidas como parte do ambiente ocular. É importante identificar a microbiota do olho para compreender os processos infecciosos que o afetam e direcionar racionalmente os tratamentos adequados.
Aprovação ética
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) sob protocolo 35271.
Declaração de disponibilidade de dados
Todos os dados relevantes para o estudo estão incluídos no artigo ou carregados como informação suplementar.
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Finaciamento
Este trabalho foi apoiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código Financeiro 001, Conselho Nacional de Pesquisa - Brasil (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul - Brasil (FAPERGS) e Propesq/UFRGS.
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