Resumo

Esta revisão tem como objetivo discutir os principais fatores envolvidos no desenvolvimento de folículos antrais iniciais até a dependência de gonadotrofinas. Essa fase folicular é caracterizada por intensa proliferação de células da granulosa, formação de uma cavidade preenchida por líquido, diferenciação morfológica das células do cumulus, células da granulosa murais e recrutamento de células da teca. A interação entre oócito, células da granulosa e da teca é determinante para o crescimento folicular e produção hormonal. Fatores de crescimento produzidos pelo oócito, fator de crescimento e diferenciação-9 (GDF-9) e proteína morfogenética óssea-15 (BMP-15), regulam a proliferação e diferenciação de células da granulosa, e o desenvolvimento da cavidade antral, bem como estimulam a produção de receptores do hormônio folículo estimulante (FSH) nas células da granulosa. Em resposta ao FSH, as células da granulosa secretam o peptídeo natriurético tipo C (CNP), que atua através de seu receptor para aumentar a produção de monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) e consequentemente o desenvolvimento folicular. As células da granulosa também produzem o fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-1) e aumentam a atividade da enzima aromatase, o que resulta em maior sensibilidade às gonadotrofinas e esteroidogênese folicular. A ausência de sinalização do IGF-1 causa cessação do crescimento folicular no início do estágio antral. Muitos outros fatores locais estão envolvidos na regulação do desenvolvimento folicular. Por tanto essa revisão traz dados relevantes para uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no controle do crescimento de folículos antrais iniciais, enfatizando o papel dos fatores endócrinos e parácrinos, a interação oócito-células da granulosa e os processos de atresia folicular. Os desafios para o estabelecimento de sistemas de cultivo eficientes para o crescimento in vitro de folículos antrais iniciais também são discutidos.

Palavras-chave:
Oócito; células da granulosa; células da teca; gonadotrofinas; células do cumulus; foliculogênese

Abstract

This review aims to discuss the main factors involved in the development of early antral follicles until gonadotropin dependence. This follicular phase is characterized by intense proliferation of granulosa cells, formation of a fluid-filled cavity, morphological differentiation of cumulus cells, mural granulosa cells and recruitment of theca cells. The interaction between oocyte, granulosa and theca cells is crucial for follicular growth and hormone production. Growth factors produced by the oocyte, such as growth and differentiation factor-9 (GDF-9) and bone morphogenetic protein-15 (BMP-15), regulate granulosa cell proliferation and differentiation and antral cavity development, as well as stimulate the production of follicle-stimulating hormone (FSH) receptors in granulosa cells. In response to FSH, granulosa cells secrete C-type natriuretic peptide (CNP), which acts through its receptor to increase cyclic guanosine monophosphate (cGMP) production and consequently follicular development. Granulosa cells also produce insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and increase aromatase enzyme activity, which results in greater sensitivity to gonadotropins and follicular steroidogenesis. The absence of IGF-1 signaling causes cessation of follicular growth at the early antral stage. Many other local factors are involved in the regulation of follicular development. Therefore, this review brings relevant data for a better understanding of the mechanisms involved in the control of early antral follicle growth, emphasizing the role of endocrine and paracrine factors, the oocyte-granulosa cell interaction and the processes of follicular atresia. The challenges for the establishment of efficient culture systems for in vitro growth of early antral follicles are also discussed.

Keywords:
Oocyte; granulosa cells; theca cells; gonadotropins; cumulus cells; folliculogenesis

1. Introdução

A competência oocitária se refere à capacidade do gameta feminino atingir a maturação, ser fertilizado e sustentar o desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto(¹1 Sirait B, Wiweko B, Jusuf AA, Iftitah D, Muharam R. Oocyte competence biomarkers associated with oocyte maturation: Frontiers in Cell and Developmental Biology. 2021. 30(9): 710292. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2021.710292
https://doi.org/10.3389/fcell.2021.71029... ). De acordo com Dode et al.(²2 Dode MAN, Rodovalho NC, Ueno VG, Alves RGO. Effect of follicle size in nuclear and cytoplasmic maturation of oocytes from zebu cows, Pesquisa Agropecuaria Brasileira. 2000; 35: 207-214. DOI: https://doi.org/10.1590/S0100-204X2000000100023
https://doi.org/10.1590/S0100-204X200000... ), esta competência é adquirida gradualmente durante o crescimento folicular pré-antral e antral inicial. Para reforçar esta informação, oócitos de folículos antrais de 3,0 mm são capazes de completar a maturação nuclear in vitro, enquanto aqueles de folículos menores (1,0 e 2,0 mm) apresentam competência reduzida(³3 Pavlok A, Lucas-Hahn A, Niemann H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 1992; 31: 63-67. DOI: https://doi.org/10.1002/mrd.1080310111
https://doi.org/10.1002/mrd.1080310111... ,⁴4 Nemcová L, Hulínska P, Ješeta M, Kempisty B, Kanka J, Machatková M. Expression of selected mitochondrial genes during in vitro maturation of bovine oocytes related to their meiotic competence. Theriogenology. 2019; 133: 104-112. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2019.05.001
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology... ). Essa não competência dos oócitos de pequenos folículos antrais se deve à redução da expressão de genes que ativam vias de sinalização para aumentar a capacidade do oócito de responder ao aumento das gonadotrofinas(⁵5 Varmosfaderani SR, Hajian M, Jafarpour F, Zadegan FG, Nasr-Esfahani MH. Granulosa secreted factors improve the developmental competence of cumulus oocyte complexes from small antral follicles in sheep. PloS one. 2020; 15: e0229043. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0229043
https://doi.org/10.1371/journal.pone.022... ). A capacidade de resposta às gonadotrofinas permite que os folículos cresçam até a seleção e dominância (⁶6 Oliveira MEF, Ferreira RM, Mingoti GZ. Local and systemic control of bovine follicular growth and selection. Revista Brasileira de Reprodução Animal. 2011; 35: 418-432. Disponível em http://www.cbra.org.br
http://www.cbra.org.br... ,⁷7 Silva JR, Figueiredo JR, Van Den Hurk R. Involvement of growth hormone (GH) and insulin-like growth factor (IGF) system in ovarian folliculogenesis. Theriogenology. 2009; 71(8):1193-208. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2008.12.01
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology... ).

No curso do desenvolvimento folicular, a proliferação e diferenciação morfológica das células da granulosa são de grande importância para preparar o folículo para responder às gonadotrofinas e para criar um ambiente favorável ao desenvolvimento do oócito(⁸8 Baumgartem SC, Stocco C. Granulosa Cells. Encyclopedia of Reproduction. 2018; 2: 8-13. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801238-3.64623-8
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801238... ). As células da granulosa produzem vários fatores autócrinos e parácrinos que podem estar envolvidos no crescimento do oócito e na formação do antro(⁹9 Vasconcelos GL, Saraiva MVA, Costa JJN, Passos MJ, Silva AWB, Rossi RODS, et al. Effects of growth differentiation factor-9 and FSH on in vitro development, viability and mRNA expression in bovine preantral follicles. Reproduction, Fertility and Development. 2012; 25: 1194-1203. DOI: http://dx.doi.org/10.1071/RD12173
http://dx.doi.org/10.1071/RD12173... ). Além disso, os fatores derivados do oócito estimulam a expressão dos receptores do hormônio folículo estimulante (FSHR) nas células da granulosa, para permitir que elas se tornem responsivas às gonadotrofinas (¹⁰10 Kim JW, Kang KM, Yoon TK, Shim SH, Lee WS. Study of circulating hepcidin in association with iron excess, metabolic syndrome, and BMP-6 expression in granulosa cells in women with polycystic ovary syndrome. Fertility and Sterility. 2014;102(2):548-554.e2. DOI: https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2014.04.031
https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.201... ). O hormônio folículo estimulante (FSH) induz a proliferação e viabilidade do complexo oócito-cúmulos-granulosa e também pode induzir a diferenciação das células da granulosa (¹¹11 Sakaguchi K, Huang W, Yang Y, Yanagawa Y, Nagano M. Relationship between in vitro growth of bovine oocytes and steroidogenesis of granulosa cells cultured in medium supplemented with bone morphogenetic protein-4 and follicle stimulating hormone. Theriogenology. 2017; 97: 113-123. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.theriogenology.2017.04.030.
http://dx.doi.org/10.1016/j.theriogenolo... ). Além disso, fatores derivados de oócitos também estimulam a formação da cavidade antral, aumentando a expressão de proteoglicanos, como resultado da interação com o FSH(⁹9 Vasconcelos GL, Saraiva MVA, Costa JJN, Passos MJ, Silva AWB, Rossi RODS, et al. Effects of growth differentiation factor-9 and FSH on in vitro development, viability and mRNA expression in bovine preantral follicles. Reproduction, Fertility and Development. 2012; 25: 1194-1203. DOI: http://dx.doi.org/10.1071/RD12173
http://dx.doi.org/10.1071/RD12173... ). Assim, a compreensão dos mecanismos endócrinos, parácrinos e autócrinos que controlam a interação entre as células foliculares e o oócito em folículos antrais iniciais favorece o desenvolvimento de estratégias para promover o seu desenvolvimento in vitro(¹²12 Paulino LRFM, de Assis EIT, Azevedo VAN, Silva BR, da Cunha EV, Silva JRV. Why Is It So Difficult To Have Competent Oocytes from In vitro Cultured Preantral Follicles? Reproductive Sciences. 2022; 29(12):3321-3334. DOI: https://doi.org/10.1007/s43032-021-00840-8
https://doi.org/10.1007/s43032-021-00840... ).

A presente revisão fornece uma visão geral dos principais fatores que controlam o desenvolvimento de folículos antrais iniciais até a dependência de gonadotrofinas, ou seja, regulação da proliferação de células da granulosa, esteroidogênese, atresia, interação entre oócitos e células da granulosa, bem como as estratégias para promover o desenvolvimento de folículos antrais precoces in vitro.

2. Controle endócrino do desenvolvimento do folículo antral inicial

O desenvolvimento folicular desde o estágio pré-antral até o estágio antral inicial é controlado principalmente por reguladores intraovarianos, mas pode ser estimulado pelo FSH. Os receptores específicos para FSH são expressos nas células da granulosa dos folículos secundários e antrais iniciais(¹³13 Pangas SA, Rajkovic A. Matzuk MM. CHAPTER 10 - Follicular development: mouse, sheep, and human models. In: Jimmy D. Neill, Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction (Third Edition), Academic Press, 2006, pages 383-423, ISBN 9780125154000.). Quando os folículos secundários são formados, as células da granulosa expressam FSHR e as células da teca expressam o receptor do hormônio luteinizante (LHR)(¹⁴14 Orisaka M, Jiang JY, Orisaka S, Kotsuji F, Tsang BK. Growth differentiation factor 9 promotes rat preantral follicle growth by up-regulating follicular androgen biosynthesis. Endocrinology. 2009; 150: 2740-2748. DOI: https://doi.org/10.1210/en.2008-1536
https://doi.org/10.1210/en.2008-1536... ). Nas espécies domésticas e humanas, a formação do antro é observada quando os folículos têm cerca de 0,2mm(¹⁵15 Gougeon A. Dynamics of follicular growth in the human: A model from preliminary results. Human Reproduction. 1986; 1: 81-87. DOI: https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.humrep.a136365
https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.h... ) e tornam-se dependentes de gonadotrofina quando atingem 3,0mm na vaca(¹⁶16 Campbell BK, Scaramuzzi RJ and Webb R. Control of antral follicle development and selection in sheep and cattle. Journal Reproduction Fertility, Supplement, 1995; 49: 335–350. DOI: https://hdl.handle.net/102.100.100/231568?index=1
https://hdl.handle.net/102.100.100/23156... ), 4,0mm na ovelha(¹⁷17 Webb RB, Nicholas JG, Gong BK, Campbell CG, Gutierrez HA, Garverick DG. Mechanism regulating follicular development and selection of the dominant follicle. Reproduction, Supplement. 2003; 23: 123- 234. DOI: https://cir.nii.ac.jp/crid/1573387450361202816
https://cir.nii.ac.jp/crid/1573387450361... ), 3,0mm na cabra(¹⁸18 Berlinguer F, Leoni GG, Succu S, Spezzigu A, Madeddu M and Satta V. Exogenous melatonin positively influences follicular dynamics, oocyte developmental competence and blastocyst output in a goat model. Journal of Pineal Research. 2009; 46: 383-391. doi https://doi.org/10.1111/j.1600-079X.2009.00674.x
https://doi.org/10.1111/j.1600-079X.2009... ) e 5,0 mm em humanos(¹⁹19 Zeleznik AJ, Plant TM. Control of the Menstrual Cycle. Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction 2014: 1307 1362. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-571136-4.50008-5
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-571136... ). O crescimento e maturação folicular além deste estágio, que inclui recrutamento, seleção, dominância e ovulação, é dependente de gonadotrofinas(²⁰20 Kumar TR, Wang Y, Lu N, Matzuk MM. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature Genetics.1997; 15: 201- 204. DOI: https://doi.org/10.1038/ng0297-201
https://doi.org/10.1038/ng0297-201... ,²¹21 McGee EA, Hsueh AJ. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles. Endocrinology Review. 2000; 21: 200-214. DOI: https://doi.org/10.1210/edrv.21.2.0394
https://doi.org/10.1210/edrv.21.2.0394... ). A aquisição da dependência de FSH durante este intervalo de crescimento é crucial para determinar o destino folicular, isto é, crescimento ou atresia. O peptídeo natriurético tipo C (CNP) é secretado pelas células da granulosa dos folículos secundários e antrais em resposta à estimulação do FSH. O CNP atua através do seu receptor (NPRB) expresso nas células da granulosa dos folículos secundários e aumenta a produção de guanosina 3’,5’-monofosfato cíclico (cGMP) para estimular o desenvolvimento folicular(³³33 Sato Y, Cheng Y, Kawamura K, Takae S, Hsueh AJ.. C-type natriuretic peptide stimulates ovarian follicle development. Molecular endocrinology.2012, 26(7), 1158-1166. DOI: https://doi.org/10.1210/me.2012-1027
https://doi.org/10.1210/me.2012-1027... ). Análises de expressão gênica indicaram aumentos nos transcritos para receptores CNP (NPP e NPRB) durante a foliculogênese inicial em camundongos, em associação com aumentos nos peptídeos CNP ovarianos(³³33 Sato Y, Cheng Y, Kawamura K, Takae S, Hsueh AJ.. C-type natriuretic peptide stimulates ovarian follicle development. Molecular endocrinology.2012, 26(7), 1158-1166. DOI: https://doi.org/10.1210/me.2012-1027
https://doi.org/10.1210/me.2012-1027... ) (Figura 1).

O fator de crescimento e diferenciação 9 (GDF-9) e a proteína morfogenética óssea 15 (BMP-15), ambos secretados pelo oócito, promovem a proliferação de células da granulosa e o recrutamento de células da teca, eventos necessários para a transição dos folículos do estágio primário ao secundário(³⁴34 Alam Md, Hasanur JL, Takashi M. GDF9 and BMP15 induce development of antrum-like structures by bovine granulosa cells without oocytes. The Journal of Reproduction and development. 2018; 64(5): 423-431. DOI: http://doi.org/10.1262/jrd.2018-078
http://doi.org/10.1262/jrd.2018-078... ). Fatores produzidos pelos folículos secundários, incluindo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento transformante (TGF), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento de fibroblastos 2 e -7 (FGF-2 e FGF-7), BMPs e a ativina são necessárias para a sobrevivência e desenvolvimento folicular adicional. Na fase antral, os peptídeos sintetizados localmente desempenham um papel fundamental na regulação do desenvolvimento folicular, através de mecanismos endócrinos e parácrinos(¹⁷17 Webb RB, Nicholas JG, Gong BK, Campbell CG, Gutierrez HA, Garverick DG. Mechanism regulating follicular development and selection of the dominant follicle. Reproduction, Supplement. 2003; 23: 123- 234. DOI: https://cir.nii.ac.jp/crid/1573387450361202816
https://cir.nii.ac.jp/crid/1573387450361... , ³⁵35 Reinen PS, Coria MS, Barrionuevo MG, Hernández O, Callejas S, Palma GA. Gene expression of growth factor BMP15, GDF9, FGF2 and their receptors in bovine follicular cells/Gene expression of growth factor BMP15, GDF9, FGF2 and their receptors in bovine follicular cells. MVZ Córdoba. 2018; 3(23): 6778-6787. DOI: http://doi.org/10.21897/rmvz.1367.
http://doi.org/10.21897/rmvz.1367... ). Dentre esses peptídeos, aqueles do sistema IGF, incluindo IGF-1, IGF-2 e as proteínas de ligação ao IGF (IGFBPs) e alguns membros da família FGF, como FGF-2, FGF-7 (ou KGF), FGF- 8 e FGF-10(³⁵35 Reinen PS, Coria MS, Barrionuevo MG, Hernández O, Callejas S, Palma GA. Gene expression of growth factor BMP15, GDF9, FGF2 and their receptors in bovine follicular cells/Gene expression of growth factor BMP15, GDF9, FGF2 and their receptors in bovine follicular cells. MVZ Córdoba. 2018; 3(23): 6778-6787. DOI: http://doi.org/10.21897/rmvz.1367.
http://doi.org/10.21897/rmvz.1367... ,³⁶36 Morikawa R, Jibak L,Takashi M. Effects of oocyte-derived growth factors on the growth of porcine oocytes and oocyte–cumulus cell complexes in vitro. The Journal of Reproduction and Develoment. 2021; 67(4): 273-281. DOI: http://doi.org/10.1262/jrd.2021-026
http://doi.org/10.1262/jrd.2021-026... ), parecem ser críticos para o desenvolvimento folicular em estágio avançado (Figura 1).

Fushii et al.(²²22 Fushimi Y, Takagi M, Monniaux D, Uno S, Kokushi E, Shinya U. Effects of dietary contamination by zearalenone and its metabolites on serum anti-Müllerian hormone: Impact on the reproductive performance of breeding cows. Reproduction. 2021; 50: 834-839. DOI: https://doi.org/10.1111/rda.12599
https://doi.org/10.1111/rda.12599... ) mostraram recentemente que complexos cumulus-oócitos (CCOs) cultivados com FSH apresentam formação de cavidade antral um dia antes daqueles que não receberam esse hormônio, mostrando a importância do FSH no desenvolvimento folicular. Reguladores intraovarianos, IGF, ativina, fatores derivados de oócitos e proteínas das junções comunicantes desempenham um papel central na aquisição da dependência de FSH no estágio antral inicial do desenvolvimento folicular(¹³13 Pangas SA, Rajkovic A. Matzuk MM. CHAPTER 10 - Follicular development: mouse, sheep, and human models. In: Jimmy D. Neill, Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction (Third Edition), Academic Press, 2006, pages 383-423, ISBN 9780125154000.). Os andrógenos derivados da teca ligam-se aos receptores de andrógenos (ARs) nas células da granulosa(²³23 Tetsuka M, Whitelaw PF, Bremner WJ, Millar MR, Smyth CD, Hillier SG. Developmental regulation of androgen receptor in rat ovary. Journal of Endocrinology. 1995; 145: 535-543. DOI: https://doi.org/10.1677/joe.0.1450535
https://doi.org/10.1677/joe.0.1450535... ), induzindo assim a expressão de FSHR e o crescimento folicular durante a transição pré-antral para antral(¹⁴14 Orisaka M, Jiang JY, Orisaka S, Kotsuji F, Tsang BK. Growth differentiation factor 9 promotes rat preantral follicle growth by up-regulating follicular androgen biosynthesis. Endocrinology. 2009; 150: 2740-2748. DOI: https://doi.org/10.1210/en.2008-1536
https://doi.org/10.1210/en.2008-1536... , ²⁴24 Vendola KA, Zhou J, Adesanya OO, Weil SJ, Bondy CA. Androgens stimulate early stages of follicular growth in the primate ovary. Journal of Clinical Investigation. 1998; 101: 2622-2629. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI2081
https://doi.org/10.1172/JCI2081... , ²⁵25 Wang H, Andoh K, Hagiwara H. Effect of adrenal and ovarian androgens on type 4 follicles unresponsive to FSH in immature mice. Endocrinology. 2001; 142: 4930-4936. DOI: https://doi.org/10.1210/endo.142.11.8482
https://doi.org/10.1210/endo.142.11.8482... ). A deficiência de AR no ovário de camundongos induz a apoptose das células da granulosa, interrompe o crescimento do folículo antral e resulta em falência ovariana prematura (²⁶26 Shiina H, Matsumoto T, Sato T. Premature ovarian failure in androgen receptor-deficient mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2006; 103: 224-229. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0506736102
https://doi.org/10.1073/pnas.0506736102... ,²⁷27 Sen A, Hammes SR. Granulosa cell-specific androgen receptors are critical regulators of ovarian development and function. Molecular Endocrinology.2010; 24: 1393-1403. DOI: https://doi.org/10.1210/me.2010-0006
https://doi.org/10.1210/me.2010-0006... ,²⁸28 Walters KA, Middleton LJ, Joseph SR. Targeted loss of androgen receptor signaling in murine granulosa cells of preantral and antral follicles causes female subfertility. Molecular Biology Reports. 2012; 87: 151. DOI: https://doi.org/10.1095/biolreprod.112.102012
https://doi.org/10.1095/biolreprod.112.1... ). Assim, os andrógenos desempenham um papel importante no crescimento, sobrevivência e aquisição da dependência de FSH nos folículos antrais iniciais(¹³13 Pangas SA, Rajkovic A. Matzuk MM. CHAPTER 10 - Follicular development: mouse, sheep, and human models. In: Jimmy D. Neill, Knobil and Neill’s Physiology of Reproduction (Third Edition), Academic Press, 2006, pages 383-423, ISBN 9780125154000.) (Figura 1).

O hormônio anti-Mülleriano (AMH) é um produto das células da granulosa a partir de pequenos folículos antrais que tem papel inibitório ou retardador no desenvolvimento dos folículos antrais. O AMH reduz a sensibilidade folicular ao FSH, diminuindo a expressão do FSHR. Inibe o recrutamento cíclico dependente de FSH e parece desempenhar um papel em todo o crescimento folicular independente de gonadotrofinas. Apesar de existir uma relação regulatória entre andrógenos e AMH, não é possível garantir que seus efeitos sejam mediados pelo estradiol, via aromatização da testosterona(²⁹29 Dewailly D, Robin G, Peigne M, Decanter C, Pigny P, Catteau-Jonard S. Interactions between androgens, FSH, anti-Müllerian hormone and estradiol during folliculogenesis in the human normal and polycystic ovary. Human Reproduction Update.2016; 22: 709-724. DOI: https://doi.org/10.1093/humupd/dmw027
https://doi.org/10.1093/humupd/dmw027... ) (Figura 1).

A melatonina é encontrada no fluido folicular dos folículos antrais humanos e tem papéis importantes no controle do desenvolvimento folicular(³⁰30 Khan H L, Bhatti S, KhanYL, Abbas S, Munir Z, Sherwani IAR et al. Cell-free nucleic acids and melatonin levels in human follicular fluid predict embryo quality in patients undergoing in-vitro fertilization treatment. J. Gynecol. Obstet. Human Reproduction. 2020; 49: (1), 101624. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jogoh.2019.08.007
https://doi.org/10.1016/j.jogoh.2019.08.... ). Seus receptores foram previamente detectados em células da granulosa de folículos pré-antrais e antrais(³¹31 Barros VRP, Cavalcante AYP, Macedo TJS, Barberino RS, Lins TLB, Gouveia BB et al. Immunolocalization of melatonin and follicle-stimulating hormone receptors in caprine ovaries and their effects during in vitro development of isolated pre-antral follicles. Reproduction. 2013; 48: 1025–1033. DOI: https://doi.org/10.1111/rda.12209
https://doi.org/10.1111/rda.12209... ). Em relação aos efeitos da melatonina, Barros et al.(³²32 Barros VRP, Monte APO, Santos JMS, Lins TLBG, Cavalcante, AYP, Gouveia, BB. Melatonin improves development, mitochondrial function and promotes the meiotic resumption of sheep oocytes from in vitro grown secondary follicles. Theriogenology. 2020; 144: 67-73. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2019.12.006
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology... ) demonstraram que esse hormônio está associado à competência meiótica de oócitos de folículos antrais iniciais. A melatonina mantém a sobrevivência folicular, estimula a formação da cavidade antral e o subsequente crescimento folicular e oocitário, bem como aumenta os níveis de glutationa e de mitocôndrias metabolicamente ativas após cultura in vitro de folículos secundários de ovelhas(³²32 Barros VRP, Monte APO, Santos JMS, Lins TLBG, Cavalcante, AYP, Gouveia, BB. Melatonin improves development, mitochondrial function and promotes the meiotic resumption of sheep oocytes from in vitro grown secondary follicles. Theriogenology. 2020; 144: 67-73. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2019.12.006
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology... ).

3. Interação oócito-célula da granulosa durante o desenvolvimento de folículos antrais iniciais

É bem sabido que durante o desenvolvimento folicular; membros da família do fator de crescimento transformante beta (TGFβ) e seus receptores estão envolvidos no controle do crescimento de oócitos e proliferação de células da granulosa. Membros da família TGFβ derivados de oócitos, como GDF-9 e BMP-15, regulam a proliferação e diferenciação de células da granulosa, bem como o desenvolvimento da cavidade antral(³³33 Sato Y, Cheng Y, Kawamura K, Takae S, Hsueh AJ.. C-type natriuretic peptide stimulates ovarian follicle development. Molecular endocrinology.2012, 26(7), 1158-1166. DOI: https://doi.org/10.1210/me.2012-1027
https://doi.org/10.1210/me.2012-1027... ,³⁴34 Alam Md, Hasanur JL, Takashi M. GDF9 and BMP15 induce development of antrum-like structures by bovine granulosa cells without oocytes. The Journal of Reproduction and development. 2018; 64(5): 423-431. DOI: http://doi.org/10.1262/jrd.2018-078
http://doi.org/10.1262/jrd.2018-078... ). Além disso, estudos recentes indicam que estes fatores regulam a expressão de RNAm para LHR em células do cumulus(³⁵35 Reinen PS, Coria MS, Barrionuevo MG, Hernández O, Callejas S, Palma GA. Gene expression of growth factor BMP15, GDF9, FGF2 and their receptors in bovine follicular cells/Gene expression of growth factor BMP15, GDF9, FGF2 and their receptors in bovine follicular cells. MVZ Córdoba. 2018; 3(23): 6778-6787. DOI: http://doi.org/10.21897/rmvz.1367.
http://doi.org/10.21897/rmvz.1367... ). O GDF-9 derivado de oócitos promove o crescimento de complexos cumulus-oócitos (CCOs), enquanto a BMP-15 induz a expressão do RNAm do receptor de coriogonadotrofina (LHCGR) nas células do cumulus e a expressão do receptor de FSH nos folículos. Tais fatores contribuem para o desenvolvimento folicular e maturação oocitária(³⁵35 Reinen PS, Coria MS, Barrionuevo MG, Hernández O, Callejas S, Palma GA. Gene expression of growth factor BMP15, GDF9, FGF2 and their receptors in bovine follicular cells/Gene expression of growth factor BMP15, GDF9, FGF2 and their receptors in bovine follicular cells. MVZ Córdoba. 2018; 3(23): 6778-6787. DOI: http://doi.org/10.21897/rmvz.1367.
http://doi.org/10.21897/rmvz.1367... ,³⁶36 Morikawa R, Jibak L,Takashi M. Effects of oocyte-derived growth factors on the growth of porcine oocytes and oocyte–cumulus cell complexes in vitro. The Journal of Reproduction and Develoment. 2021; 67(4): 273-281. DOI: http://doi.org/10.1262/jrd.2021-026
http://doi.org/10.1262/jrd.2021-026... ). GDF-9 e BMP-15 ligam-se ao receptor BMP tipo II(³⁷37 Ma X, Huashan Y. BMP15 regulates FSHR via TGF-ß II receptor and SMAD4 signaling in the prepubertal ovary of Rongchang pigs. Research in Veterinary Science. 2022; 143: 66-73. DOI: http://doi.org/10.1016/j.rvsc.2021.12.013
http://doi.org/10.1016/j.rvsc.2021.12.01... ) e recrutam quinases semelhantes a ativina do tipo 5 (ALK5)(³⁸38 Vitt UA, Mazerbourg S, Klein C, Hsueh AJ. Bone morphogenetic protein receptor type II is a receptor for growth differentiation factor-9. Biology of reproduction. 2002; 67: 473-480. DOI: http://doi.org/10.1095/biolreprod67.2.473
http://doi.org/10.1095/biolreprod67.2.47... ) e 6 (ALK6)(³⁹39 Mazerbourg S, Klein C, Roh J, Kaivo-Oja N, Mottershead DG, Korchynskyi O, et al. Growth differentiation factor-9 signaling is mediated by the type I receptor, activin receptor-like kinase 5. M Endocrinology 2004;18.3: 653-665. DOI: http://doi.org/10.1210/me.2003-0393
http://doi.org/10.1210/me.2003-0393... ) para, em seguida, regular proteínas SMAD em células da granulosa. Estudos indicam que o GDF-9 aumenta o crescimento e a diferenciação dos folículos pré-antrais em cultivo(⁴⁰40 Juengel JL, Bodensteiner KJ, Heath DA, Hudson NL, Moeller CL, Smith P, et al. Physiology of GDF9 and BMP15 signalling molecules. A reproduction science 2004; 82: 447-460. DOI: http://doi.org/10.1016/j. anireprosci.2004.04.021
http://doi.org/10.1016/j. anireprosci.20... ) e promove a biossíntese e proliferação de andrógenos nas células da teca(⁴¹41 Vitt UA, McGee EA, Hayashi M, Hsueh AJ. In vivo treatment with GDF-9 stimulates primordial and primary follicle progression and theca cell marker CYP17 in ovaries of immature rats. Endocrinology 2000; 141.10: 3814-3820. DOI: http://doi.org/10.1210/endo.141.10.7732
http://doi.org/10.1210/endo.141.10.7732... ). Além desses fatores, a proteína R-espondina2 também é um importante fator parácrino que pode promover a proliferação de células da granulosa(⁴²42 Spicer LJ, Aad PY, Allen DT, Mazerbourg S, Payne AH, Hsueh AJ. Growth differentiation factor 9 (GDF9) stimulates proliferation and inhibits steroidogenesis by bovine theca cells: influence of follicle size on responses to GDF9. Biology of Reproduction 2008;78.2: 243-253. DOI: http://doi.org/10.1095/biolreprod.107.063446
http://doi.org/10.1095/biolreprod.107.06... ). O FGF-2 e seus respectivos receptores também estão envolvidos no desenvolvimento inicial dos folículos antrais(³⁶36 Morikawa R, Jibak L,Takashi M. Effects of oocyte-derived growth factors on the growth of porcine oocytes and oocyte–cumulus cell complexes in vitro. The Journal of Reproduction and Develoment. 2021; 67(4): 273-281. DOI: http://doi.org/10.1262/jrd.2021-026
http://doi.org/10.1262/jrd.2021-026... , ⁴³43 Cheng Y, Kawamura K, Taka S, Deguchi M, Yang Q, Kuo C, et. Oocyte-derived R-spondin2 promotes ovarian follicle development. Jornal FASEB 2013;27: 2175-2184. DOI: http://doi.org/10.1096/fj.12-223412
http://doi.org/10.1096/fj.12-223412... , ⁴⁴44 Chang HM, Fang L, Cheng JC, Taylor EL, Sun YP, Leung PC. Effects of growth differentiation factor 8 on steroidogenesis in human granulosa-lutein cells. Fertility and sterility 2016;105: 520-528. DOI: http://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.10.034
http://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015... ). O FGF-2 sozinho ou em associação com VEGF-A influencia a esteroidogênese e a proliferação de células da granulosa de búfalos, regulando a expressão de RNAm do citocromo P450 19A1 (CYP19A1), antígeno nuclear de proliferação célular (PCNA) e proteína X associada a Bcl-2 (BAX)(⁴⁴44 Chang HM, Fang L, Cheng JC, Taylor EL, Sun YP, Leung PC. Effects of growth differentiation factor 8 on steroidogenesis in human granulosa-lutein cells. Fertility and sterility 2016;105: 520-528. DOI: http://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015.10.034
http://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2015... ,⁴⁵45 Mishra SR, Thakur N, Somal A, Parmar MS, Reshma R, Rajesh G, et al. “Expression and localization of fibroblast growth factor (FGF) family in buffalo ovarian follicle during different stages of development and modulatory role of FGF2 on steroidogenesis and survival of cultured buffalo granulosa cells. Research in Veterinary Science 2016; 108: 98-111. DOI: http://doi.org/10.1016/j.rvsc.2016.08.012
http://doi.org/10.1016/j.rvsc.2016.08.01... ) (Figura 2). Além disso, Mattar et al.(⁴⁶46 Mattar D., Samir M., Laird M., Knight PG. Modulatory effects of TGF-ß1 and BMP6 on thecal angiogenesis and steroidogenesis in the bovine ovary. Reproduction. 2020;159(4), 397-408. DOI: https://doi.org/10.1530/REP-19-0311
https://doi.org/10.1530/REP-19-0311... ) relataram que o VEGF-A e o FGF-2 promovem a formação de redes de células endoteliais durante o cultivo in vitro de células da teca, tais estruturas apoiam o desenvolvimento folicular sucessivo até o estágio pré-ovulatório.

As células da granulosa desempenham um papel no desenvolvimento dos folículos antrais, promovendo o desenvolvimento do complexo oócito-células da granulosa e fornecendo trifosfato de adenosina (ATP) aos oócitos(⁴⁸48 Yang Y, Kanno C, Huang W, Kang SS, Yanagawa Y, Nagano M. Effect of bone morphogenetic protein-4 on in vitro growth, steroidogenesis and subsequent developmental competence of the oocyte-granulosa cell complex derived from bovine early antral follicles. Reproductive Biology and Endocrinology 2016; 14:1: 1-8. doi; http://doi.org/10.1186/s12958-016-0137-1
http://doi.org/10.1186/s12958-016-0137-1... ). Além disso, Yang et al.(⁴⁸48 Yang Y, Kanno C, Huang W, Kang SS, Yanagawa Y, Nagano M. Effect of bone morphogenetic protein-4 on in vitro growth, steroidogenesis and subsequent developmental competence of the oocyte-granulosa cell complex derived from bovine early antral follicles. Reproductive Biology and Endocrinology 2016; 14:1: 1-8. doi; http://doi.org/10.1186/s12958-016-0137-1
http://doi.org/10.1186/s12958-016-0137-1... ) demonstraram a influência do BPM-4, derivado de células da teca, na esteroidogênese em folículos antrais iniciais. O CNP também é um fator estimulante para folículos antrais iniciais(³⁰30 Khan H L, Bhatti S, KhanYL, Abbas S, Munir Z, Sherwani IAR et al. Cell-free nucleic acids and melatonin levels in human follicular fluid predict embryo quality in patients undergoing in-vitro fertilization treatment. J. Gynecol. Obstet. Human Reproduction. 2020; 49: (1), 101624. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jogoh.2019.08.007
https://doi.org/10.1016/j.jogoh.2019.08.... ) (Figura 2). Em associação com as células da granulosa, as células da teca contribuem para a síntese da inibina α; que é um hormônio que inibe a produção de FSH(⁴⁹49 Laird, M., Glister, C., Cheewasopit, W., Satchell, L. S., Bicknell, A. B., Knight, P. G. Free inhibin a subunit is expressed by bovine ovarian theca cells and its knockdown suppresses androgen production. Scientific reports, 2019. 9(1), 19793. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-019-55829-w
https://doi.org/10.1038/s41598-019-55829... ). Yang et al.(⁴⁸48 Yang Y, Kanno C, Huang W, Kang SS, Yanagawa Y, Nagano M. Effect of bone morphogenetic protein-4 on in vitro growth, steroidogenesis and subsequent developmental competence of the oocyte-granulosa cell complex derived from bovine early antral follicles. Reproductive Biology and Endocrinology 2016; 14:1: 1-8. doi; http://doi.org/10.1186/s12958-016-0137-1
http://doi.org/10.1186/s12958-016-0137-1... ) demonstraram a influência do BPM-4, proveniente das células da teca, na esteroidogênese e nos folículos antrais iniciais.

4. Controle da proliferação de células da granulosa e produção de estradiol durante o desenvolvimento de folículos antrais iniciais

Nos folículos antrais iniciais, as células da granulosa são altamente proliferativas, mas suscetíveis à apoptose. Os fatores secretados pelo oócito, como GDF-9 e BMP-15, regulam a proliferação e sobrevivência das células da granulosa(⁵⁰50 Sun T, Diaz FJ. Ovulatory signals alter granulosa cell behavior through YAP1 signaling. Reproductive Biology Endocrinology. 2019; 17(1):113. DOI: https://doi.org/10.1186/s12958-019-0552-1
https://doi.org/10.1186/s12958-019-0552-... ,⁵¹51 McNatty KP, Juengel JL, Reader KL, Lun S, Myllymaa S, Lawrence SB, et al. Bone morphogenetic protein 15 and growth differentiation factor 9 co-operate to regulate granulosa cell function in ruminants. Reproduction. 2005; 129(4): 481-7. DOI: https://doi.org/10.1530/rep.1.0511
https://doi.org/10.1530/rep.1.0511... ). Além disso, a proliferação de células da granulosa depende da ciclina D2 para ativar os membros da família CDK2, CDK4 e CDK6 da quinase dependente de ciclina (CDK)(⁵²52 Hoque SAM, Kawai T, Zhu Z, Shimada M. Mitochondrial protein turnover is critical for granulosa cell proliferation and differentiation in antral follicles. Journal of the Endocrine Society. 2018; 3(2): 324-339. DOI: https://doi.org/10.1210/js.2018-00329
https://doi.org/10.1210/js.2018-00329... ). Nos folículos em desenvolvimento, o FSH estimula a proliferação das células da granulosa e a aromatização de andrógenos em estrogênios. Os estrogénios também estimulam a proliferação das células da granulosa(⁵³53 Alam MH, Miyano T. Interaction between growing oocytes and granulosa cells in vitro. Reproductive Medicine and Biology. 2019; 19(1): 13-23. DOI: https://doi.org/10.1002/rmb2.12292
https://doi.org/10.1002/rmb2.12292... ). Um aumento no estradiol está associado a um aumento na expressão de genes para aromatase, 3β-HSD e receptores para FSH e LH nas células da granulosa (Figura 2)(⁵⁴54 Orisaka M, Hattori K, Fukuda S, Mizutani T, Miyamoto K, Sato T, et al. Dysregulation of ovarian follicular development in female rat: LH decreases FSH sensitivity during preantral-early antral transition. Endocrinology. 2013; 154(8): 2870-80. DOI: https://doi.org/10.1210/en.2012-2173
https://doi.org/10.1210/en.2012-2173... ).

O neuropeptídeo neuronal Y (NPY) está fortemente presente nas células da granulosa e a abundância de mRNA para o NPY é maior nos folículos antrais iniciais do que nos folículos antrais tardios. Além disso, o NPY aumenta a proliferação de células da granulosa através do receptor NPY Y5 (NPY5R) e da proteína quinase ativada por mitógeno (MEK)(⁵⁵55 Urata Y, Salehi R, Lima PDA, Osuga Y, Tsang BK. Neuropeptide Y regulates proliferation and apoptosis in granulosa cells in a follicular stage-dependent manner. Journal of Ovarian Research. 2020; 13(1): 5. DOI: https://doi.org/10.1186/s13048-019-0608-z
https://doi.org/10.1186/s13048-019-0608-... ). Baddela et al. (⁵⁶56 Baddela VS, Sharma A, Michaelis M, Vanselow J. HIF1 driven transcriptional activity regulates steroidogenesis and proliferation of bovine granulosa cells. Scientific Reports. 2020; 10(1): 3906. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-60935-1
https://doi.org/10.1038/s41598-020-60935... ) relataram que, nas células da granulosa, o fator 1 indutível por hipóxia (HIF1) regula transcricionalmente genes associados à esteroidogênese, como proteína reguladora aguda da esteroidogênese (StAR), 3B-hidroxiesteróide desidrogenase (HSD3B) e CYP19A1) e proliferação (CCND2 e PCNA). O início da expressão do mRNA do StAR ocorre em folículos antrais iniciais de 1,0 mm de diâmetro(⁵⁷57 Braw-Tal R, Roth Z. Gene expression for LH receptor, 17 alpha-hydroxylase and StAR in the theca interna of preantral and early antral follicles in the bovine ovary. Reproduction. 2005; 129(4): 453-61. DOI: https://doi.org/10.1530/rep.1.00464
https://doi.org/10.1530/rep.1.00464... ). Além disso, FSH e LH, juntamente com citocinas intraovarianas, induzem a expressão de enzimas esteroidogênicas em células da granulosa, incluindo StAR, CYP11a1, 3βHSD e CYP19a1, como mostra a Figura 3 (⁵⁸58 Samie KA, Tabandeh MR, Afrough M. Betaine ameliorates impaired steroidogenesis and apoptosis in mice granulosa cells induced by high glucose concentration. Systems Biology in Reproductive Medicine. 2020; 66(6): 400-409. DOI: https://doi.org/10.1080/19396368.2020.1811423
https://doi.org/10.1080/19396368.2020.18... ). A expressão de RNAm para LHR é encontrada em células da granulosa de folículos menores que 5 mm (⁵⁹59 Douville G, Sirard MA. Changes in granulosa cells gene expression associated with growth, plateau and atretic phases in medium bovine follicles. Journal of Ovarian Research. 2014; 7: 50. DOI: https://doi.org/10.1186/1757-2215-7-50
https://doi.org/10.1186/1757-2215-7-50... ).

O potencial esteroidogênico folicular envolve uma série extensa e altamente coordenada de estágios de desenvolvimento. Durante esse processo, após intensa proliferação das células da granulosa e da teca (até 100 vezes), elas se diferenciam em células endócrinas especializadas. Os esteroides ovarianos são sintetizados pela cooperação dessas células. As células da teca sintetizam andrógenos através da atividade enzimática do citocromo P450 17A1 (CYP17A1) (⁵³53 Alam MH, Miyano T. Interaction between growing oocytes and granulosa cells in vitro. Reproductive Medicine and Biology. 2019; 19(1): 13-23. DOI: https://doi.org/10.1002/rmb2.12292
https://doi.org/10.1002/rmb2.12292... ). Folículos maiores que 2 mm de diâmetro expressaram fortemente mRNAs de LH-R e CYP17A1 na maioria das células da teca (⁵⁵55 Urata Y, Salehi R, Lima PDA, Osuga Y, Tsang BK. Neuropeptide Y regulates proliferation and apoptosis in granulosa cells in a follicular stage-dependent manner. Journal of Ovarian Research. 2020; 13(1): 5. DOI: https://doi.org/10.1186/s13048-019-0608-z
https://doi.org/10.1186/s13048-019-0608-... ). Os andrógenos são então convertidos em estrogênios pela aromatase (CYP19) produzida pelas células da granulosa. Além disso, a progesterona é produzida pelas células da granulosa e utilizada pelas células da teca para sintetizar andrógenos (⁶⁰60 Jeon MJ, Choi YS, Yoo JJ, Atala A, Jackson JD. Optimized culture system to maximize ovarian cell growth and functionality in vitro. Cell Tissue Research. 2021; 385(1): 161-171. DOI: https://doi.org/10.1007/s00441-021-03415-w
https://doi.org/10.1007/s00441-021-03415... ). StAR, CYP11a1 e CYP19a1 são as principais enzimas no processo de síntese hormonal (⁶¹61 Wang N, Zhao F, Lin P, Zhang G, Tang K, Wang A, et al. Knockdown of XBP1 by RNAi in Mouse Granulosa Cells Promotes Apoptosis, Inhibits Cell Cycle, and Decreases Estradiol Synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 2017; 18(6): 1152. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms18061152
https://doi.org/10.3390/ijms18061152... ) (Figura 3).

As células da granulosa expressam o receptor de estradiol, que contribui para o desenvolvimento folicular (⁶²62 Kishi H, Kitahara Y, Imai F, Nakao K, Suwa H. Expression of the gonadotropin receptors during follicular development. Reproductive Medicine and Biology. 2017; 17(1): 11-19. DOI: https://doi.org/10.1002/rmb2.12075
https://doi.org/10.1002/rmb2.12075... ). As atividades autócrinas e parácrinas do estradiol nas células da granulosa estimulam a atividade da enzima aromatase, aumentando a sensibilidade à gonadotrofina e a expressão do IGF-1 (⁵⁹59 Douville G, Sirard MA. Changes in granulosa cells gene expression associated with growth, plateau and atretic phases in medium bovine follicles. Journal of Ovarian Research. 2014; 7: 50. DOI: https://doi.org/10.1186/1757-2215-7-50
https://doi.org/10.1186/1757-2215-7-50... ). No ovário, o IGF-I estimula a esteroidogênese folicular e aumenta a produção de estradiol. A ausência de IGF-I resulta na interrupção do crescimento folicular na fase pré-antral/antral inicial, uma vez que estes folículos não respondem à gonadotrofina (⁶⁰60 Jeon MJ, Choi YS, Yoo JJ, Atala A, Jackson JD. Optimized culture system to maximize ovarian cell growth and functionality in vitro. Cell Tissue Research. 2021; 385(1): 161-171. DOI: https://doi.org/10.1007/s00441-021-03415-w
https://doi.org/10.1007/s00441-021-03415... ,⁶¹61 Wang N, Zhao F, Lin P, Zhang G, Tang K, Wang A, et al. Knockdown of XBP1 by RNAi in Mouse Granulosa Cells Promotes Apoptosis, Inhibits Cell Cycle, and Decreases Estradiol Synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 2017; 18(6): 1152. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms18061152
https://doi.org/10.3390/ijms18061152... ). Nas células da granulosa, o efeito estimulador do FSH no CYP19 e na proteína quinase B (AKT) depende do IGF-I e da expressão e ativação do IGF-IR (61). Além disso, o FSH induz a produção de estradiol através da sinalização dependente de FSHR-cAMP para induzir a transcrição do gene CYP19A1 (⁷⁷77 Yamamoto K, Otoi T, Koyama N, Horikita N, Tachikawa S, Miyano T. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 1999; 52: 81-89. DOI: https://doi.org/10.1016/S0093-691X(99)00111-9
https://doi.org/10.1016/S0093-691X(99)00... ). Após o recrutamento folicular, as gonadotrofinas reduzem gradativamente a proliferação das células da granulosa e induzem sua diferenciação para produzir estradiol (⁶⁸68 Meng L, Jan SZ, Hamer G, van Pelt AM, van der Stelt I, Keijer J, Teerds KJ. Preantral follicular atresia occurs mainly through autophagy, while antral follicles degenerate mostly through apoptosis. Biology of Reproduction. 2018; 1;99(4):853-863. DOI: https://doi.org/10.1093/biolre/ioy116
https://doi.org/10.1093/biolre/ioy116... ) (Figura 3).

5. Atresia folicular durante o desenvolvimento de folículos antrais iniciais

Ao nascer, os ovários contêm milhares de folículos, mas apenas uma pequena proporção se desenvolve até a ovulação, enquanto a grande maioria (~99,9) é perdida por atresia. A atresia folicular não ocorre igualmente durante o desenvolvimento folicular, diferindo entre folículos pré-antrais e folículos antrais (⁶⁸68 Meng L, Jan SZ, Hamer G, van Pelt AM, van der Stelt I, Keijer J, Teerds KJ. Preantral follicular atresia occurs mainly through autophagy, while antral follicles degenerate mostly through apoptosis. Biology of Reproduction. 2018; 1;99(4):853-863. DOI: https://doi.org/10.1093/biolre/ioy116
https://doi.org/10.1093/biolre/ioy116... ). Spanel-Borowski et al. (⁶⁹69 Spanel-Borowski K. Follicle stages and follicular atresia. In Atlas of the Mammalian Ovary Morphological Dynamics and Potential Role of Innate Immunity. Spanel-Borowski K, Germany, 2012, pp. 9-22. DOI: https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-642-30535-1
https://link.springer.com/book/10.1007/9... ) relataram dois tipos de padrões atrésicos em folículos ovarianos, nomeadamente o tipo A, no qual o oócito degenera enquanto as células da granulosa permanecem intactas, e o tipo B, no qual as células da granulosa mostram sinais de degeneração extensa enquanto o oócito permanece inicialmente não afetado. O tipo A é a forma predominante de atresia nos folículos pré-antrais (⁷⁰70 Silva JR, Báo SN, Lucci CM, Carvalho FC, Andrade ER, Ferreira MA, Figueiredo JR. Morphological and ultrastructural changes occurring during degeneration of goat preantral follicles preserved in vitro. Animal Reproduction Science. 2001; 66(3-4):209-223. DOI: https://doi.org/10.1016/s0378-4320(01)00102-6
https://doi.org/10.1016/s0378-4320(01)00... ), enquanto nos folículos antrais tardios apenas se observa o tipo B, sendoa apoptose das células da granulosa na presença a principal característica da atresia em folículos antrais grandes (⁶⁹69 Spanel-Borowski K. Follicle stages and follicular atresia. In Atlas of the Mammalian Ovary Morphological Dynamics and Potential Role of Innate Immunity. Spanel-Borowski K, Germany, 2012, pp. 9-22. DOI: https://link.springer.com/book/10.1007/978-3-642-30535-1
https://link.springer.com/book/10.1007/9... ). Nos folículos antrais iniciais, as primeiras alterações que indicam atresia ocorrem no oócito, como retração da cromatina nuclear e fragmentação do oócito, enquanto alterações nas células da granulosa nesses folículos são raramente encontradas (⁷⁰70 Silva JR, Báo SN, Lucci CM, Carvalho FC, Andrade ER, Ferreira MA, Figueiredo JR. Morphological and ultrastructural changes occurring during degeneration of goat preantral follicles preserved in vitro. Animal Reproduction Science. 2001; 66(3-4):209-223. DOI: https://doi.org/10.1016/s0378-4320(01)00102-6
https://doi.org/10.1016/s0378-4320(01)00... ).

Quando o ambiente parácrino ou endócrino não é adequado para suportar o crescimento dos oócitos e/ou a proliferação e diferenciação de células foliculares, a atresia pode ocorrer através das vias de necrose, necroptose, autofagia e apoptose (⁷¹71 Pajokh M, Mesbah F, Bordbar H, Talaei-Khozani T. Different cell death types determination in juvenile mice ovarian follicles. Iranian Journal of Veterinary Research. 2018;19(4): 298-303. DOI: PMC6361600.
https://doi.org/PMC6361600... ) (Figura 4). A via de necrose e necroptose apresentam características morfológicas semelhantes e são caracterizadas por aumento do volume celular, permeabilização e ruptura da membrana plasmática, que levam à morte celular (⁷¹71 Pajokh M, Mesbah F, Bordbar H, Talaei-Khozani T. Different cell death types determination in juvenile mice ovarian follicles. Iranian Journal of Veterinary Research. 2018;19(4): 298-303. DOI: PMC6361600.
https://doi.org/PMC6361600... ). Geralmente, a necrose é iniciada por mecanismos não celulares, como isquemia, deficiência nos níveis de ATP e trauma, levando a danos celulares irreversíveis (⁷¹71 Pajokh M, Mesbah F, Bordbar H, Talaei-Khozani T. Different cell death types determination in juvenile mice ovarian follicles. Iranian Journal of Veterinary Research. 2018;19(4): 298-303. DOI: PMC6361600.
https://doi.org/PMC6361600... ). A necroptose é iniciada pelo fator de necrose tumoral-α (TNFα) e operada através da proteína quinase-1 e 3, que interagem com seus receptores serina / treonina-proteína quinase 1 e quinase 3, respectivamente, bem como pelo domínio semelhante proteína de linhagem mista quinase (MLKL) (⁷¹71 Pajokh M, Mesbah F, Bordbar H, Talaei-Khozani T. Different cell death types determination in juvenile mice ovarian follicles. Iranian Journal of Veterinary Research. 2018;19(4): 298-303. DOI: PMC6361600.
https://doi.org/PMC6361600... ). Zhou et al. (⁷²72 Zhou J, Peng X, Mei S. Autophagy in ovarian follicular development and atresia. International Journal of Biological Sciences. 2019; 15: 726-737. DOI: https://doi.org/10.7150/ijbs.30369
https://doi.org/10.7150/ijbs.30369... ) mostraram que o processo de autofagia está envolvido com atresia em folículos secundários e antrais iniciais. A autofagia é uma forma evolutivamente conservada de processo intracelular que envolve proteínas e organelas danificadas para degradação e reciclagem (Figura 4).

Acredita-se que a apoptose das células da granulosa nos folículos antrais tardios seja desencadeada por níveis insuficientes de FSH ou número reduzido de receptores de FSH (⁷³73 Soares PHA, Junqueira FS. Reproductive features of the bovine female: Review. Pubvet. 2019; 13: 1-6. DOI: https://doi.org/10.31533/pubvet.v13n02a257.1-6
https://doi.org/10.31533/pubvet.v13n02a2... ). A ausência de LH e o declínio do FSH circulante fazem com que os folículos subordinados diminuam o seu crescimento e, eventualmente, resulta em atresia (⁷⁴74 Landry DA, Sirard M. Follicle capacitation: A meta-analysis to investigate the transcriptome dynamics following FSH decline in bovine granulosa cells. Biology of Reproduction. 2018; 99: 877-887. DOI: https://doi.org/10.1093/biolre/ioy090
https://doi.org/10.1093/biolre/ioy090... ). O FSH protege as células da granulosa do dano oxidativo e resgata as células da granulosa da apoptose. Acredita-se que o FSH resgate as células da granulosa dos folículos antrais da apoptose por meio da ativação da via de transdução do sinal fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K)–AKT. A ativação da fosfoinositídeo 3-quinase (PI3K)/Akt através da ligação do FSH ao seu receptor leva à fosforilação da subfamília box O dos fatores de transcrição forkhead (FOXO), que influencia, entre outros processos, a sobrevivência das células da granulosa (⁷⁵75 Meng L, Jan SZ, Hamer G, Van Pelt AM, Van der Stelt I, Keijer J. et al. Preantral follicular atresia occurs mainly through autophagy, while antral follicles degenerate mostlythrough apoptosis. Biology of Reproduction. 2018; 99: 853-863. DOI: https://doi.org/10.1093/biolre/ioy116
https://doi.org/10.1093/biolre/ioy116... ).

6. Estratégias para o desenvolvimento in vitro de folículos antrais iniciais

Vários estudos investigaram a relação entre o tamanho folicular e oocitário com a aquisição de competência de desenvolvimento oocitária in vitro, e muitos estudos concentraram-se no desenvolvimento de protocolos de cultivo que podem apoiar o desenvolvimento de oócitos a partir de folículos antrais iniciais (Figura 5). Harada et al. (⁷⁶76 Harada M, Miyano T, Matsumura K, Osaki S, Miyake M, Kato S. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 1997; 48: 743-755. DOI: https://doi.org/10.1016/S0093-691X(97)00298-7
https://doi.org/10.1016/S0093-691X(97)00... ) demonstraram pela primeira vez que oócitos de 90,0 a 99,0 µm de folículos antrais iniciais (0,5 a 0,7 mm) de bovinos podem crescer e adquirir competência de desenvolvimento in vitro, na presença de hipoxantina e FSH. Da mesma forma, Yamamoto et al. (⁷⁷77 Yamamoto K, Otoi T, Koyama N, Horikita N, Tachikawa S, Miyano T. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 1999; 52: 81-89. DOI: https://doi.org/10.1016/S0093-691X(99)00111-9
https://doi.org/10.1016/S0093-691X(99)00... ) demonstraram que, além de serem capazes de crescer e adquirir competência de desenvolvimento in vitro, oócitos (90,0 a 99,0µm) de pequenos folículos bovinos eram capazes de produzir descendentes após passarem por maturação, fertilização e posterior cultivo in vitro.

Ao cultivar folículos antrais isolados com diâmetro entre 0,2 e 0,5 mm, observou-se que, assim como os CCOs (0,4 e 0,7), os folículos também podem crescer durante o cultivo in vitro, e os oócitos atingem competência meiótica (⁷⁸78 Alm H, Katska-Ksiazkiewicz L, Rynska B, Tuchscherer A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 2006; 65: 1422-1434. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2005.08.014
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology... ). Na espécie caprina, além de obter melhora na maturação oocitária in vitro, foi relatada a produção de embriões a partir de oócitos provenientes de pequenos folículos antrais cultivados in vitro (⁷⁹79 de Sá NA, Ferreira AC, Sousa FG, Duarte AB, Paes VM, Cadenas J, et al. First pregnancy after in vitro culture of early antral follicles in goats: positive effects of anethole on follicle development and steroidogenesis. Molecular Reproduction and Development. 2020; 87: 966-977. DOI: https://doi.org/10.1002/mrd.23410
https://doi.org/10.1002/mrd.23410... ). Cadenas et al. (⁸⁰80 Cadenas J, Leiva-Revilla J. Vieira LA, Apolloni LB, Aguiar FLN, Alves BG, et al. Caprine ovarian follicle requirements differ between preantral and early antral stages after IVC in medium supplemented with GH and VEGF alone or in combination. Theriogenology. 2017; 87: 321-332. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2016.09.008
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology... ) mostraram que folículos antrais iniciais de cabras cultivados em meio contendo insulina (10 ng/mL) associada ao hormônio do crescimento (50 ng/mL) são capazes de manter o crescimento e a maturação de oócitos in vitro em níveis semelhantes aos que cresceram in vivo. Da mesma forma, ao observar o efeito da estimulação do FSH humano recombinante (hrFSH) nos folículos antrais iniciais de cabra, o hrFSH melhorou o desenvolvimento do folículo antral de maneira dependente da concentração (⁸¹81 Ferreira, ACA, Cadenas J, Sá NA, Correia HH, Guerreiro DD, Lobo CH, et al. In vitro culture of isolated preantral and antral follicles of goats using human recombinant FSH: Concentration-dependent and stage-specific effect. Animal Reproduction Science. 2018; 196: 120-129. DOI: https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2018.07.004
https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.20... ). Lopes e al. (⁸²82 Lopes EPF, Rodrigues GQ, de Brito DCC, Rocha RMP, Ferreira ACA, de Sá NA, et al. Vitrification of caprine secondary and early antral follicles as a perspective to preserve fertility function. Reproductive Biology. 2020; 20: 371-378. DOI: https://doi.org/10.1016/j.repbio.2020.05.001
https://doi.org/10.1016/j.repbio.2020.05... ) também demonstraram que folículos antrais inicias isolados de estroma ovariano caprino são capazes de crescer e sobreviver in vitro por um curto período de tempo, após passarem por um processo de vitrificação. Em bovinos, recentemente Cordeiro et al. (⁸³83 Cordeiro EB, Silva BR, Paulino LR, Barroso PA, Barrozo LG, de Lima Neto MF, and Silva JR. Effects of N-acetylcysteine on growth, viability and reactive oxygen species levels in small antral follicles cultured in vitro. Asian Pacific Journal of Reproduction, 2023; 12(1), 42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2021.106801
https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.20... ) relataram que a presença de N-acetilcisteína (NAC) no meio de cultivo de folículos antrais iniciais reduz os níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) e mantém a integridade dos oócitos durante o cultivo.

O cultivo in vitro de CCO e folículos isolados garante a comunicação bidirecional entre oócitos e células da granulosa através de projeções transzonais (TZPs), o que é crucial para a ocorrência de eventos moleculares necessários ao desenvolvimento folicular e oocitário até a ovulação. Tais eventos envolvem, além da separação cromossômica, a caracterização da maturação nuclear, envolvem também a distribuição de organelas citoplasmáticas, o estoque de RNAm, proteínas e outros fatores, que são cruciais para que o ovócito consiga retomar a meiose e apoiar a fertilização e o desenvolvimento embrionário (⁸⁴84 Jiang Y, He Y, Pan X, Wang P, Yuan X, Ma B. Advances in oocyte maturation in vivo and in vitro in mammals. International Journal of Molecular Sciences. 2023; 21;24(10):9059. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24109059
https://doi.org/10.3390/ijms24109059... ).

Alguns estudos já relataram o nascimento de bezerros vivos a partir de oócitos recuperados de folículos antrais iniciais, mas a viabilidade e a competência de desenvolvimento destes oócitos in vitro podem ser melhoradas (⁷⁷77 Yamamoto K, Otoi T, Koyama N, Horikita N, Tachikawa S, Miyano T. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 1999; 52: 81-89. DOI: https://doi.org/10.1016/S0093-691X(99)00111-9
https://doi.org/10.1016/S0093-691X(99)00... , ⁸⁵85 Huang W, Nagano M, Kang SS, Yanagawa Y, Takahashi Y. Effects of in vitro growth culture duration and prematuration culture on maturational and developmental competences of bovine oocytes derived from early antral follicles. Theriogenology 2013; 80:793–9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2013.07.004
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology... , ⁸⁶86 Senbon S, Miyano T. Bovine oocytes in early antral follicles grow in serum- free media: effect of hypoxanthine on follicular morphology & oocyte growth. Zygote 2002;10:301–9. DOI: https://doi.org/10.1017/S0967199402004033
https://doi.org/10.1017/S096719940200403... ). Assim, nosso grupo de pesquisa tem se concentrado no desenvolvimento de protocolos de cultivo que favoreçam a aquisição de competência oocitária in vitro. Bezerra et al.(⁸⁷87 Bezerra FTG, Silva AWB, Rissi VB, Rosa PA, Cesaro MP, Costa JJN, Gonçalves PBD and Silva JRV. Cilostamide and follicular hemisections inhibit oocyte meiosis resumption and regulate gene expression and cAMP levels in bovine cumulus–oocyte complexes. Livestock Science, 2016; 184, 112–118. DOI: https://doi.org/10.1016/j.livsci.2015.12.014
https://doi.org/10.1016/j.livsci.2015.12... ) demonstraram que hemissecções foliculares em associação com cilostamida apresentam efeito sinérgico na manutenção de oócitos na vesícula germinativa durante cultivo in vitro. Barrozo et al.(⁸⁸88 Barrozo LG, Silva BR, Paulino LR, Barbalho EC, Nascimento DR, Costa FC, and Silva JR. N-acetyl cysteine reduces levels of reactive oxygen species and improves in vitro maturation of oocytes from medium-sized bovine antral follicles. Zygote, 2022; 30(6), 882-890. DOI: https://doi.org/10.1017/S0967199422000429
https://doi.org/10.1017/S096719942200042... ) mostraram que a presença desse NAC no meio de cultura aumenta a porcentagem de retomada meiótica e a distribuição de TZPs, bem como reduz os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROS), indicando que a inclusão de antioxidantes é importante para otimizar os sistemas de MIV. Este e outros autores (⁸⁹89 He Y, Meng K, Wang X, Dong, Z, Zhang, Y, Quan F. Comparison of bovine small antral follicle development in two-and three-dimensional culture systems. Annals of the Brazilian Academy of Sciences. 2020; 92, e20180935. DOI: https://doi.org/10.1590/0001-3765202020180935
https://doi.org/10.1590/0001-37652020201... ) sugeriram que o sistema de cultura bidimensional (2D) é mais adequado para culturas de oócitos de folículos antrais precoces com duração de até 4 dias, enquanto em períodos de cultura superiores a 4 dias, o sistema tridimensional (3D) é mais adequado.

A cultura de folículos antrais iniciais isolados também pode representar uma alternativa promissora para o fornecimento de oócitos competentes para utilização em protocolos de maturação in vitro (⁹⁰90 Bezerra FTG, Lima FEO, Paulino LRFM, Silva BR, Silva AWB, Souza ALP, Van Den Hurk R and Silva JRV. In vitro culture of secondary follicles and prematuration of cumulus–oocyte complexes from antral follicles increase the levels of maturation-related transcripts in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 2019; 86 (12), 1874–1886. DOI: https://doi.org/10.1002/mrd.23284
https://doi.org/10.1002/mrd.23284... ), uma vez que esta comunicação entre ovócitos e células da granulosa é mantida. Porém, a escolha do tamanho folicular é fundamental para a aquisição de competência no desenvolvimento oocitário. Já foi demonstrado que oócitos de folículos antrais inicias (1 e 2mm) apresentam competência significativamente reduzida em comparação com oócitos de folículos antrais maiores (>3mm) (³3 Pavlok A, Lucas-Hahn A, Niemann H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 1992; 31: 63-67. DOI: https://doi.org/10.1002/mrd.1080310111
https://doi.org/10.1002/mrd.1080310111... ,⁴4 Nemcová L, Hulínska P, Ješeta M, Kempisty B, Kanka J, Machatková M. Expression of selected mitochondrial genes during in vitro maturation of bovine oocytes related to their meiotic competence. Theriogenology. 2019; 133: 104-112. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2019.05.001
https://doi.org/10.1016/j.theriogenology... ). Bezerra et al. (⁹⁰90 Bezerra FTG, Lima FEO, Paulino LRFM, Silva BR, Silva AWB, Souza ALP, Van Den Hurk R and Silva JRV. In vitro culture of secondary follicles and prematuration of cumulus–oocyte complexes from antral follicles increase the levels of maturation-related transcripts in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 2019; 86 (12), 1874–1886. DOI: https://doi.org/10.1002/mrd.23284
https://doi.org/10.1002/mrd.23284... ) demonstraram que os níveis de RNAm para transcritos envolvidos no processo de desenvolvimento do oócito, como histona com ligante específico do oócito (H1FOO), GDF-9 e ribonuclease poli (a) específica (PARN), aumentam em oócitos quando os folículos crescem de folículos antrais secundários para pequenos, médios e grandes.

7. Conclusões

O desenvolvimento de folículos antrais inicias até a dependência de gonadotrofinas envolve uma ampla gama de processos, que podem ser decisivos para o crescimento folicular, esteroidogênese e aquisição de competência oocitária. A interação mútua entre oócitos e células foliculares influencia diretamente o destino folicular e do oócito. Além disso, o cultivo in vitro de folículos antrais iniciais abre novas perspectivas para utilização de seus oócitos para fertilização in vitro e proporciona uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos no controle de folículos antrais iniciais.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelas bolsas de estudo. J.R.V. Silva é pesquisador do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico -CNPq (bolsa número 308737/2018-0).

References

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