Resumo

As vitaminas C e E são potentes antioxidantes que reduzem os efeitos nocivos do estresse em várias espécies, incluindo peixes. Neste estudo, avaliou-se o efeito das vitaminas C, E e sua combinação na aerocistite aguda induzida por Aeromonas hydrophila inativada em pacu. 288 peixes foram distribuídos em 4 grupos suplementados por 90 dias: G1-controle; G2-suplementado com 500 mg de Vitamina C; G3-suplementado com 500 mg de Vitamina E; G4-suplementado com 500 mg de Vitamina C + 500 mg de Vitamina E. Os peixes foram divididos em três grupos, o primeiro não foi inoculado; o segundo foi inoculado na bexiga natatória com 3 x 10⁹ UTC de A. hydrophila inativada e a última com soro fisiológico. O exsudato inflamatório foi coletado da bexiga natatória para avaliação do componente celular e citoquímica. Os resultados mostraram maior acúmulo de leucócitos nos peixes inoculados com a bactéria. A citoquímica foi eficaz na identificação de trombócitos, linfócitos, macrófagos e granulócitos presentes no exsudato. Também foi observado que os peixes que receberam suplementação com vitaminas apresentaram maior acúmulo de células totais no exsudato com predominância de linfócitos e trombócitos. Esses resultados sugeriram que a suplementação com vitaminas melhorou as respostas imunológicas.

Palavras-chave:
Aeromonas hydrophila ; citoquímica; pacu; bexiga natatória

Abstract

Vitamins C and E are potent antioxidants that reduces the harmful effects of stress in several species including fish. In this study, it was evaluated the effect of vitamins C, E and their combination in the acute aerocystitis induced by inactivated Aeromonas hydrophila in pacu. 288 fish were distributed into 4 groups supplemented for 90 days: G1-control; G2-supplemented with 500 mg of Vitamin C; G3-supplemented with 500 mg of Vitamin E; G4-supplemented with 500 mg of Vitamin C + 500 mg of Vitamin E. The fish were divided in three groups, the first was not inoculated; second were inoculated in the swim bladder with 3 x 10⁹ CFU of inactivated A. hydrophila and the last one with saline. The inflammatory exudate was collected from the swim bladder for assessment of cellular component and cytochemistry. The results showed higher accumulation of leukocytes in fish inoculated with bacteria. Cytochemistry was effective identifying thrombocytes, lymphocytes, macrophages and, granulocytes present in the exudate. It was also observed fish that received supplementation with vitamins presented higher accumulation of total cells in the exudate with a predominance of lymphocytes and thrombocytes. These results suggested that supplementation with vitamins improved the immunological responses.

Keywords:
Aeromonas hydrophila ; cytochemistry; pacu; swim bladder

1. Introdução

As vitaminas são micronutrientes importantes que são necessários para a manutenção das funções normais do corpo. Desempenha um papel importante no crescimento, resposta imune, hematologia, reprodução e resposta a estressores (¹1 R. E Ibrahim, S.A. Ahmed, S.A Amer, N.A Al-Gabri, A.I Ahmed, A.A. Abdel-Warith, M.I. Younis, A.E. Metwally Influence of vitamin C feed supplementation on the growth, antioxidant activity, immune status, tissue histomorphology, and disease resistance in Nile tilapia, Oreochromis niloticus. Aquaculture Reports, 18 (2020), p. 100545). Uma quantidade adequada desses micronutrientes é necessária para os processos catalíticos normais dentro do sistema enzimático, que consiste em uma variedade de atividades enzimáticas ligadas aos sistemas metabólico, endócrino e imunológico (²2 Keen CL, Uriu-Adams JY, Emsimsa JL, Gershwin ME. Trace elements/minerals and immunity. In: Gershwin, M.E., Nestel, P., Keen, C.L., Totowa, N.J. (Eds.), Handbook of Nutrition and Immunity. Humana Press, 2004; 117–140.). A deficiência desses micronutrientes causa muitos distúrbios metabólicos e doenças/infecções por sua influência negativa no sistema fisiológico de peixes e outros animais(³3 Ekiz C, Agaoglu L, Karakas Z, Gurel N, Yalcin I. The effect of iron deficiency anemia on the function of the immune system. Hematol. J. 2005; 5, 579–583., ⁴4 Koshio S, Angeles M. Benefficial roles of feed additives as immunostimulants in aquaculture: a review. Rev. Aquac. 2017; 1–25. https://doi.org/10.1111/raq.12209
https://doi.org/10.1111/raq.12209... ).

As vitaminas C e E são importantes para melhorar o crescimento e a saúde fisiológica dos peixes. Essas vitaminas devem ser suplementadas regularmente nas dietas dos peixes, pois a maioria dos peixes teleósteos são incapazes de sintetizá-las(⁵5 Khan, K.U., Zuberi, A., Nazir, S., Fernandes, J.B.K., Jamil, Z., Sarwar, H. Effects of dietary selenium nanoparticles on physiological and biochemical aspects of juvenile Tor putitora, Turk. J. Zool. 2016. 40, 704–712.). A vitamina C (ácido ascórbico) é um potente antioxidante que reduz os efeitos nocivos do estresse e a atividade das células inflamatórias(⁶6 Liang XP, Li Y, Hou YM, Qiu H, Zhou QC. Effect of dietary vitamin C on the growth performance, antioxidant ability and innate immunity of juvenile yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco Richardson). Aquac. Res. 2017; (48): 149-160.). A vitamina E também é um importante antioxidante que protege as membranas celulares da peroxidação lipídica e aumenta a resistência a doenças (⁷7 Etsuo N. Lipid oxidation that is, and is not, inhibited by vitamin E: Consideration about physiological functions of vitamin E. Free Radical Biology and Medicine. 2021; 176(20): 1-15., ⁸8 Pan JH, Feng L, Jiang WD, Wu P, Kuang SY, Tang L, Zhang YA, Zhou XQ, Liu Y. Vitamin E deficiency depressed fish growth, disease resistance, and the immunity and structural integrity of immune organs in grass carp (Ctenopharyngodon idella): Referring to NF-κB, TOR and Nrf2 signaling. Fish and Shellfish Immunology. 2017; 60:219-236. Disponível em: 10.1016/j.fsi.2016.11.044). Dietas suplementadas com vitaminas C e E aumentaram a atividade fagocitária e a produção de ROS (espécies reativas de oxigênio) em leucócitos renais de Spaurus aurata (⁹9 Ortuño J, Cuesta A, Esteban MA, Meseguer J. Effect of oral administration of high vitamin C and E dosages on the gilthead seabream (Spaurus aurata L.) innate immune system. Veterinary Immunology and Immunopathology. 2001. 200; 79(3-4): 167-180. Disponível em: http://www.10.1016/s0165-2427(01)00264-1
http://www.10.1016/s0165-2427(01)00264-1... ) e reduziram a mortalidade por Yersinia rukeri em Oncorhynchus mykiss (¹⁰10 Wahli T, Verlhac V, Gabaudan J, Schuep W, Meier W. Influence of combined vitamins C and E on non-specific immunity and disease resistance of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum). Journal of Fish Diseases. 1998; 21(2): 127–137. Disponível em: http://www.10.1046/j.1365-2761.1998.00088.x
http://www.10.1046/j.1365-2761.1998.0008... ). No entanto, o uso de altas doses não apresentaram benefícios contraainfecção por Streptococcus iniae (¹¹11 Sealey WM, Gatlin DM. Dietary vitamin C and vitamin E interact to influence growth and tissue composition of juvenile hybrid striped bass (Morone chrysops (female) x M. saxatilis (male) but have limited effects on immune responses. The Journal of Nutrition 2002; 132(4): 748–755. DOI: 10.1093/jn/132.4.748
https://doi.org/10.1093/jn/132.4.748... ).

Aeromonas hydrophilaé uma bactéria Gram-negativa anaeróbia facultativa que infecta uma ampla variedade de hospedeiros invertebrados e vertebrados.Empeixes, causa septicemia por aeromonas móveis(¹²12 LeTS, Nguyen TH, Vo HP, Doan VC, Nguyen HL, Tran MT, Tran TT, Southgate PC, Kurtboke DI. Protective ffects of bacteriophages against Aeromonas hydrophila species Causing Motile Aeromonas Septicemia (MAS) in striped catfish. Antibiotics (Basel). 2018; 7(1). https://doi.org/10.3390/antibiotics7010016
https://doi.org/10.3390/antibiotics70100... ).Éconsiderada uma das mais importantes doenças bacterianas, responsáveis pela perdademilhõesdedólaresnaindústria globaldeaquicultura de água doce(¹³13 Peterman MA, Posadas BC. Direct economic impact of fish diseases on the East Mississippi catfish industry. North American Journal of Aquaculture. 2019; 81(3): 222–229. https://doi.org/10.1002/naaq.10090
https://doi.org/10.1002/naaq.10090... ). Diversas suplementações com antibióticos utilizados para preveniroucontrolar infecções bacterianas foram proibidasemvários países, devidoàssuas consequências cada vez mais negativas. Considerando que compostos alternativos estão sendo aplicados para elevar a qualidadeesustentabilidadeda produção depeixes(¹⁴14 Kuebutornye FKA, Abarike ED. The contribution of medicinal plants to tilapia aquaculture: a review. Aquac. Int. 2020; (28): 965-983. https://doi.org/10.1007/s10499-020-00506-3
https://doi.org/10.1007/s10499-020-00506... , ¹⁵15 Thépot V, Campbell AH, Rimmer MA, Paul NA. Meta-analysis of the use of seaweeds and their extracts as immunostimulants for fish: a systematic review. Rev. Aquac. 2021; (13): 907-933,).

A bexiga natatória tem sido utilizada como modelo para o estudo da inflamação em peixes por ser uma cavidade com circulação terminal sem leucócitos residentes e apresentar fácil acesso para inoculaçãoecoletadeexsudato (¹⁶16 Claudiano GS, Yunis-aguinaga J, Marinho-neto, FA, Miranda, R, Martins, IM, Otani FS, Mundim AV, Marzocchi-machado CM, Moraes JRE, de Moraes, FR. Hematological and immune changes in Piaractus mesopotamicus in the sepsis induced by Aeromonas hydrophila. Fish & Shellfish Immunology. 2019; 88: 259-265., ¹⁷17 Yunis-Aguinaga J, Claudiano GS, Marcusso PF, Manrique WG, De Moraes JRE, De Moraes FR, Fernandes JB. Uncaria tomentosa increases growth and immune activity in Oreochromis niloticus challenged with Streptococcus agalactiae. Fish and Shellfish Immunology. 2015; 47(1), 630-638. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.fsi.2015.09.051
https://doi.org/10.1016/j.fsi.2015.09.05... ). Portanto, uma ótima ferramenta para avaliararesposta infamatória, bem como suas alteraçõesemanimais suplementados.

Com base no conteúdo acima, este estudo avaliou o efeito da suplementação dietética com as vitaminas C, Ee suas combinaçõesnaaerocistite aguda induzida por Aeromonas hydrophilainativa emPiaractus mesopotamicus.

2. Material e métodos

2.1 Desenho Experimentale Dietas

Este experimento foi conduzido com 288 pacus, Piaractus mesopotamicus (197,1 ± 21,5 g), em 48 tanques (250 L/n = 6) com vazão de água de 1 L min-1 e aeração contínua. A qualidade da água manteve-se na zona de conforto desta espécie (Oxigênio dissolvido = 5,3 ± 0,3 mg L-1, Temperatura = 29,4 ± 1,5°C, pH = 7,6 ± 0,1 e condutividade elétrica = 117,9 ± 5,1 μS cm-1). O protocolo ético para este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética (CEUA-UNESP) sob o protocolo número 003868/10 de acordo com as diretrizes de cuidado e uso de animais de laboratório da legislação brasileira.

Os peixes foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos: G1 não suplementado, controle (ração comercial / Vit C 66,5 mg kg-1 e Vit E 14,1 mg kg-1); G2 suplementado com 500 mg de Vitamina C por kg de ração(¹⁸18 Moraes JR, Freitas JB, Bozzo FR, Moraes FR, Martins ML. A suplementação alimentar com vitamina c acelera a evolução do processo cicatricial em Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887). Boletim do Instituto de Pesc. 2003;29:57–67.) G3 suplementado com 500 mg de Vitamina E por kg de ração (¹⁹19 Belo MAA, Moraes FR, Yoshida L, Prado EJR, Moraes JRE, Soares VE, Silva MG. Deleterious effects of low level of vitamin E and high stocking density on the hematology response of pacus, during chronic inflammatory reaction. Aquaculture. 2014; 423:124–128. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2013.12.013
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.20... ) e G4 suplementado com 500 mg de Vitamina C + 500 mg de Vitamina E por kg de ração(¹⁹19 Belo MAA, Moraes FR, Yoshida L, Prado EJR, Moraes JRE, Soares VE, Silva MG. Deleterious effects of low level of vitamin E and high stocking density on the hematology response of pacus, during chronic inflammatory reaction. Aquaculture. 2014; 423:124–128. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2013.12.013
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.20... , ²⁰20 Belo MAA, Moraes JRE, Soares VE, Martins ML, Brum CD, Moraes FR. Vitamin C and endogenous cortisol in foreignbody inflammatory response in pacus. Pesquisa Agropecuária Brasileira. 2012; 47(7): 1015-1021. Disponível em: https://doi.org/10.1590/S0100-204X2012000700019
https://doi.org/10.1590/S0100-204X201200... ).

Foi utilizada ração comercial para pacu (28%PBe 3900 kcal kg-1 DE) (Tabela 1). Polifosfato de ascorbil- 35% de atividade foi utilizado como fonte devitamina C e α-tocoferil - 50% de atividade como fonte de vitamina E. Os peixes foram alimentados duas vezes ao dia (3% da biomassa) por 90 dias (²¹21 Castro MP, Claudiano GS, Bortoluzzi NL, Garrido E, Fujimoto RY, Belo MAA, Shimada MT, Moraes JRE, Moraes FR. Chromium carbochelate dietary supplementation favored the glucocorticoid response during acute inflammation of Piaractus mesopotamicus. Aquaculture. 2014a; 432:114–118a. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2014.04.036
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.20... ). As vitaminas foram incorporadas durantea segunda moagem do processo de extrusão. Os ingredientes foram misturados mecanicamente nos tratamentos.

Ao final do experimento, as vitaminas foram quantificadas nas dietas, para vitamina C (489 mg kg-1) foi utilizada titulação(²²22 Tavares-Dias M. Cytochemical method for staining fish basophils. Journal of Fish Biology. 2006b; 69(1): 312-317b. Disponível em: https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.2006.01106.x
https://doi.org/10.1111/j.1095-8649.2006... ) e para vitamina E(484 mg kg-1) foi utilizada HPLC (²³23 Pregnolatto W, Pregnolatto NP. Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz: métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 3.ed. São Paulo: Instituto Adolfo Lutz; 1985. 533p.). Aconcentração do grupo controle de vitamina C foi de 66,5 mg kg-1 e vitamina E de 14,1 mg kg-1, confirmação descrita acima.

2.2 Indução e avaliação de aerocistite aguda por A. hydrophila

A bexiga natatória foi escolhida como modelo para estudar a inflamação por ser um órgão cavitário com circulação terminal de fácil inoculação e coleta de material para avaliação dos componentes celulares e líquidos no foco inflamatório. Outra característica importante é que não possui leucócitos residentes (¹⁶16 Claudiano GS, Yunis-aguinaga J, Marinho-neto, FA, Miranda, R, Martins, IM, Otani FS, Mundim AV, Marzocchi-machado CM, Moraes JRE, de Moraes, FR. Hematological and immune changes in Piaractus mesopotamicus in the sepsis induced by Aeromonas hydrophila. Fish & Shellfish Immunology. 2019; 88: 259-265.).

Os peixes foram anestesiados em solução de benzocaína (1: 20.000) em etanol 98° (0,1 g mL-1) (¹⁶16 Claudiano GS, Yunis-aguinaga J, Marinho-neto, FA, Miranda, R, Martins, IM, Otani FS, Mundim AV, Marzocchi-machado CM, Moraes JRE, de Moraes, FR. Hematological and immune changes in Piaractus mesopotamicus in the sepsis induced by Aeromonas hydrophila. Fish & Shellfish Immunology. 2019; 88: 259-265.). Após a anestesia, os peixes de cada tratamento (G1 – G4) foram divididos em três subgrupos, o primeiro não foi inoculado (NV); o segundo foi inoculado na bexiga natatória, região anteromedial (1cm do opérculo), na linha lateral, com agulha e seringa estéreis, com 3x10⁹ UFC de Aeromonas hydrophila inativada pelo calor em 1,0 mL de soro fisiológico 0,65% (Bactéria) e o último subgrupo injetado com o mesmo volume desolução salina 0,65%. Esta dose foi previamente determinada pelo ensaio LD50.

Após 4, 24 e 48 horas pós-inoculação (HPI), 6 peixes por tratamento e tempo. foram sacrificados sob anestesia profunda. A bexiga natatória foi lavada com 0,5 mL de solução salina tamponada com fosfato com 0,01 mL de EDTA 5% e as suspensões de células foram centrifugadas a 300 G por 10 minutos antes da coloração. A contagem total de células foi determinada com um hemocitômetro Neubauer (¹⁶16 Claudiano GS, Yunis-aguinaga J, Marinho-neto, FA, Miranda, R, Martins, IM, Otani FS, Mundim AV, Marzocchi-machado CM, Moraes JRE, de Moraes, FR. Hematological and immune changes in Piaractus mesopotamicus in the sepsis induced by Aeromonas hydrophila. Fish & Shellfish Immunology. 2019; 88: 259-265.).

Os esfregaços de exsudato foram secos ao ar, fixados e corados com Giemsaou ácido periódico-Schiff (PAS). As porcentagens de linfócitos, granulócitos, macrófagos e trombócitos foram determinadas de acordo com Claudiano et al.(¹⁶16 Claudiano GS, Yunis-aguinaga J, Marinho-neto, FA, Miranda, R, Martins, IM, Otani FS, Mundim AV, Marzocchi-machado CM, Moraes JRE, de Moraes, FR. Hematological and immune changes in Piaractus mesopotamicus in the sepsis induced by Aeromonas hydrophila. Fish & Shellfish Immunology. 2019; 88: 259-265.) e as células foram medidas pelo analisador de imagens Video Plan (Kontron Elektronik Zeiss, Alemanha)(²¹21 Castro MP, Claudiano GS, Bortoluzzi NL, Garrido E, Fujimoto RY, Belo MAA, Shimada MT, Moraes JRE, Moraes FR. Chromium carbochelate dietary supplementation favored the glucocorticoid response during acute inflammation of Piaractus mesopotamicus. Aquaculture. 2014a; 432:114–118a. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2014.04.036
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.20... ).

2.3 Caracterização citoquímica do componente celular

Os esfregaços de exsudato foram tratados pela coloração PAS para identificação do glicogênio(²⁴24 Mcmanus JFA. Histological demonstration of mucin after periodic acid. Nature, 1946; 158 (4006):202.) e, a seguir, os esfregaços com coloração positiva foram tratados pela amilase salivar para confirmar a presença de glicogênio para Tavares-Dias et al.(²⁵25 Tavares-Dias MA. Morphological and cytochemical study of erythrocytes, thrombocytes and leukocytes in four freshwater teleosts. Journal of Fish Biology. 2006a; 68(6):1822–1833a. Disponível em: https://doi.org/10.1111/j.10958649.2006.01089.x
https://doi.org/10.1111/j.10958649.2006.... , ²⁶26 Tavares-Dias M, Ono EA, Pilarski F, Moraes FR. Can thrombocytes participate in the removal of cellular debris in the blood circulation of teleost fish? A cytochemical study and ultrastructural analysis. Journal of Applied Ichthyology. 2007; 23(6): 709-712. Disponível em: https://doi.org/10.1111/j.1439-0426.2007.00850.x
https://doi.org/10.1111/j.1439-0426.2007... ). A identificação da peroxidase e da esterase inespecífica foi realizada com o peróxido de otoluidina-hidrogênio Tavares-Dias et al.(²⁵25 Tavares-Dias MA. Morphological and cytochemical study of erythrocytes, thrombocytes and leukocytes in four freshwater teleosts. Journal of Fish Biology. 2006a; 68(6):1822–1833a. Disponível em: https://doi.org/10.1111/j.10958649.2006.01089.x
https://doi.org/10.1111/j.10958649.2006.... , ²⁶26 Tavares-Dias M, Ono EA, Pilarski F, Moraes FR. Can thrombocytes participate in the removal of cellular debris in the blood circulation of teleost fish? A cytochemical study and ultrastructural analysis. Journal of Applied Ichthyology. 2007; 23(6): 709-712. Disponível em: https://doi.org/10.1111/j.1439-0426.2007.00850.x
https://doi.org/10.1111/j.1439-0426.2007... ).

2.4 Análise estatística

Os resultados foram submetidos à análise de variância e comparação de médias por meio do teste de Tukey ao nível de significância de 5%.

3. Resultados

3.1 Avaliação de aerocistite aguda por Aeromonas hydrophila

Peixes inoculados com A. hydrophila inativada apresentaram maior acúmulo de células totais (P<0,05) do que aqueles injetados com solução salina (Tabela 2). Os grupos inoculados com bactérias e suplementados com vitamina E e C + E apresentaram maior acúmulo de células totais (P<0,05) do que não suplementados e suplementados com vitamina C após 24 h. O acúmulo de células totais foi maior (P<0,05) 48 h após a inoculação com A. hydrophila nos peixes suplementados com vitamina E e C + E, em comparação aos não suplementados ou injetados com salina com ou sem vitaminas (Tabela 2). Os peixes não inoculados não apresentaram células residentes na bexiga natatória.

Após quatro horas, não foi observada diferença no número de trombócitos, linfócitos, granulócitos e macrófagos entre os grupos suplementados e não suplementados. No grupo suplementado com vitamina C + E o acúmulo de trombócitos foi maior (P<0,05) nos peixes inoculados com a bactéria em relação aos peixes injetados com soro fisiológico. Após 24 h, os peixes inoculados com A. hydrophila apresentaram maior acúmulo de trombócitos do que os peixes injetados com solução salina (p < 0,05) e não houve diferença entre os grupos suplementados (p> 0,05). O acúmulo de trombócitos em 48 h em peixes inoculados com bactérias e suplementados com vitaminas C, E e C + E foi maior (P<0,05) do que em peixes não suplementados (Tabela 2).

Os peixes inoculados com bactérias apresentaram maior acúmulo de linfócitos (p<0,05) do que os injetados com solução salina em todos os tempos. Após 4h após a injeção de solução salina em peixes suplementados, o acúmulo de linfócitos foi maior do que em peixes não suplementados. Após 24 h o acúmulo de linfócitos foi maior (p>0,05) nos suplementados com vitamina E e C + E (G3 e G4) do que naqueles suplementados com vitamina C e não suplementados (G1 e G2). Após 48h, o acúmulo de linfócitos foi maior (P<0,05) no grupo inoculado com bactérias e suplementado com vitaminas em relação ao grupo não suplementado sob o mesmo inóculo (Tabela 2).

Após 24 e 48 h, os peixes inoculados com a bactéria apresentaram maior acúmulo de macrófagos do que aqueles injetados com solução salina (p<0,05). Não houve diferença entre os grupos suplementados em relação aos não suplementados (p>0,05) (Tabela 2). Não houve diferença (p>0,05) nos granulócitos em todos os grupos e tempos diferentes (Tabela 2).

3.2 Análise citoquímica do componente celular

No exsudato infamatório foram observados macrófagos, trombócitos, granulócitos e linfócitos (Figura 1). Linfócitos e trombócitos fortemente corados com PAS. Os monócitos também foram corados, mas fracamente. Linfócitos, macrófagos e granulócitos foram positivos para peróxido de hidrogênio o-toluidina. Reação de esterase inespecífica foi observada como grânulos escuros no citoplasma de macrófagos e trombócitos (Figura 1).

4. Discussão

Os sólidos resultados obtidos neste trabalho suportam o uso da bexiga natatória como modelo para estudos de inflamação em peixes. Outros autores validaram o uso desse modelo (¹⁶16 Claudiano GS, Yunis-aguinaga J, Marinho-neto, FA, Miranda, R, Martins, IM, Otani FS, Mundim AV, Marzocchi-machado CM, Moraes JRE, de Moraes, FR. Hematological and immune changes in Piaractus mesopotamicus in the sepsis induced by Aeromonas hydrophila. Fish & Shellfish Immunology. 2019; 88: 259-265., ¹⁷17 Yunis-Aguinaga J, Claudiano GS, Marcusso PF, Manrique WG, De Moraes JRE, De Moraes FR, Fernandes JB. Uncaria tomentosa increases growth and immune activity in Oreochromis niloticus challenged with Streptococcus agalactiae. Fish and Shellfish Immunology. 2015; 47(1), 630-638. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.fsi.2015.09.051
https://doi.org/10.1016/j.fsi.2015.09.05... , ²¹21 Castro MP, Claudiano GS, Bortoluzzi NL, Garrido E, Fujimoto RY, Belo MAA, Shimada MT, Moraes JRE, Moraes FR. Chromium carbochelate dietary supplementation favored the glucocorticoid response during acute inflammation of Piaractus mesopotamicus. Aquaculture. 2014a; 432:114–118a. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2014.04.036
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.20... , ²⁷27 Castro MP, Claudiano GS, Petrillo TR, Shimada MT, Belo MAA, Marzocchi-Machado CM, Moraes JRE, Manrique WG, Moraes FR. Acute aerocystitis in Nile tilapia bred in net cages and supplemented with chromium carbochelate and Saccharomyces cerevisiae. Fish Shellfish Immunol. 2014b; 36(1): 284–290b., ²⁸28 Bozzo FR, Moraes JRE, Moraes FR, Pereira GT, Tavares-Dias M, Onaka EM. Kinetics of cellular component in inflammatory response induced by different stimuli in the swim bladder of Piaractus mesopotamicus, Holmberg, 1887 (Characidae). Journal of the World Aquaculture Society. 2007; 38(2): 302-308. Disponível em: https://doi.org/10.1111/j.1749-7345.2007.00100.x
https://doi.org/10.1111/j.1749-7345.2007... ). No entanto, até onde sabemos, esta é a primeira vez que se caracteriza o componente celular do exsudato por citoquímica após a suplementação de vitaminas C e E em Piaractus mesopotamicus. Os peixes inoculados com A. hydrophila inativada apresentaram maior acúmulo de células totais do que os peixes injetados com solução salina e não tratados, em todos os tempos, comprovando a efficiência do modelo experimental.

Os resultados deste estudo também mostraram que a análise morfológica e a citoquímica foram eficazes para identificar os tipos celulares do exsudato. Em peixes suplementados com vitaminas C, E e sua associação provocou acúmulo de células totais no sítio infamatório, principalmente trombócitos e linfócitos, o que indica uma resposta mais efficiente.

Li et al. (²⁹29 Li J., Barreda DR, Zhang YA, Boshra H, Gelman AE, Patra S, Tort L, Sunyer JO. B lymphocytes from early vertebrates have potent phagocytic and microbicidal abilities. Nature Immunology. 2006; 7(10): 1116-1124. Disponível em: https://doi.org/10.1038/ni1389
https://doi.org/10.1038/ni1389... ) mostraram que, ao contrário dos mamíferos, os linfócitos B de animais primitivos têm uma potente atividade fagocitária in vitro e in vivo. Isso sugere que essas células podem ter se originado de um tipo de célula com atividade fagocítica (³⁰30 Randelli E, Buonocore F, Scapigliati G. Cell markers and determinants in fish immunology. Fish and Shellfish Immunology. 2008; 25(4): 326–340. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.fsi.2008.03.019
https://doi.org/10.1016/j.fsi.2008.03.01... ). Neste estudo, os linfócitos apresentaram reação citoquímica positiva para grânulos de glicogênio que foram corados por PAS e peroxidase. Esses achados sustentam que os linfócitos evoluíram de um ancestral mielóide e possuem enzimas para atividade fagocítica. Como esperado, macrófagos e granulócitos também foram peroxidase-positivos.

Os trombócitos eram esterases inespecíficas e PAS-positivos. Resultados semelhantes foram observados em Oncorhynchus mykiss (³¹31 Shigdar S, Harford A, Ward AC. Cytochemical characterization of the leucocytes and thrombocytes from Murray cod (Maccullochella peelii peelii, Mitchell). Fish and Shellfish Immunology. 2006; 26(5): 731-736. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.fsi.2009.03.010
https://doi.org/10.1016/j.fsi.2009.03.01... ). Isso pode ser atribuído ao seu papel como uma célula fagocítica ativa (²⁶26 Tavares-Dias M, Ono EA, Pilarski F, Moraes FR. Can thrombocytes participate in the removal of cellular debris in the blood circulation of teleost fish? A cytochemical study and ultrastructural analysis. Journal of Applied Ichthyology. 2007; 23(6): 709-712. Disponível em: https://doi.org/10.1111/j.1439-0426.2007.00850.x
https://doi.org/10.1111/j.1439-0426.2007... ). A análise qualitativa do componente celular infamatório em peixes não suplementados corrobora os resultados de Bozzo et al. (²⁸28 Bozzo FR, Moraes JRE, Moraes FR, Pereira GT, Tavares-Dias M, Onaka EM. Kinetics of cellular component in inflammatory response induced by different stimuli in the swim bladder of Piaractus mesopotamicus, Holmberg, 1887 (Characidae). Journal of the World Aquaculture Society. 2007; 38(2): 302-308. Disponível em: https://doi.org/10.1111/j.1749-7345.2007.00100.x
https://doi.org/10.1111/j.1749-7345.2007... ) onde predominaram trombócitos e linfócitos. Isso sustenta que ambos têm um papel importante na defesa contra patógenos, conforme demonstrado anteriormente por Tavares-Dias et al (²⁶26 Tavares-Dias M, Ono EA, Pilarski F, Moraes FR. Can thrombocytes participate in the removal of cellular debris in the blood circulation of teleost fish? A cytochemical study and ultrastructural analysis. Journal of Applied Ichthyology. 2007; 23(6): 709-712. Disponível em: https://doi.org/10.1111/j.1439-0426.2007.00850.x
https://doi.org/10.1111/j.1439-0426.2007... ).

A suplementação com vitaminas C, E e C + E potencializa a resposta em pelo menos uma das avaliações. Asuplementação dietética com vitamina C em peixes inoculados com bactérias potencializou a resposta infamatória corroborando achados anteriores em inflamação crônica (^{18, 20}20 Belo MAA, Moraes JRE, Soares VE, Martins ML, Brum CD, Moraes FR. Vitamin C and endogenous cortisol in foreignbody inflammatory response in pacus. Pesquisa Agropecuária Brasileira. 2012; 47(7): 1015-1021. Disponível em: https://doi.org/10.1590/S0100-204X2012000700019
https://doi.org/10.1590/S0100-204X201200... ) na mesma espécie e melhorou a resposta imune e o crescimento em peixes (⁸8 Pan JH, Feng L, Jiang WD, Wu P, Kuang SY, Tang L, Zhang YA, Zhou XQ, Liu Y. Vitamin E deficiency depressed fish growth, disease resistance, and the immunity and structural integrity of immune organs in grass carp (Ctenopharyngodon idella): Referring to NF-κB, TOR and Nrf2 signaling. Fish and Shellfish Immunology. 2017; 60:219-236. Disponível em: 10.1016/j.fsi.2016.11.044).

Peixes suplementados com vitamina E e inoculados com a bactéria apresentaram maior número total de células na bexiga natatória em relação ao grupo não suplementado. A vitamina E é um potente antioxidante que inibe a ação dos radicais livres e aumenta a resistência a doenças (⁷7 Etsuo N. Lipid oxidation that is, and is not, inhibited by vitamin E: Consideration about physiological functions of vitamin E. Free Radical Biology and Medicine. 2021; 176(20): 1-15.). Sua defficiência potencializa os efeitos nocivos do estresse em P. mesopotamicus mantido em alta densidade populacional(³²32 Belo MAA, Schalch SHC, Moraes FR, Soares VE, Otoboni AMMB, Moraes JER. Effect of dietary supplementation with vitamin E and stocking density on macrophage recruitment and giant cell formation in the Teleost Fish, Piaractus mesopotamicus. J Journal of Comparative Pathology. 2005; 54(2-3):133-146. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2005.04.004
https://doi.org/10.1016/j.jcpa.2005.04.0... ).

Pacus alimentados com dieta deficiente em vitamina E apresentam uma correlação negativa entre o número de monócitos e o cortisol plasmático, indicando a suscetibilidade ao efeito supressor dos glicocorticóides(¹⁹19 Belo MAA, Moraes FR, Yoshida L, Prado EJR, Moraes JRE, Soares VE, Silva MG. Deleterious effects of low level of vitamin E and high stocking density on the hematology response of pacus, during chronic inflammatory reaction. Aquaculture. 2014; 423:124–128. Disponível em: https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2013.12.013
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.20... ). Níveis elevados de cortisol circulante diminuem a adesão de leucócitos ao endotélio vascular, diapedese e quimiotaxia de monócitos pela inibição da síntese de eicosanóides(¹⁶16 Claudiano GS, Yunis-aguinaga J, Marinho-neto, FA, Miranda, R, Martins, IM, Otani FS, Mundim AV, Marzocchi-machado CM, Moraes JRE, de Moraes, FR. Hematological and immune changes in Piaractus mesopotamicus in the sepsis induced by Aeromonas hydrophila. Fish & Shellfish Immunology. 2019; 88: 259-265.).

Observamos que peixes suplementados com a combinação de vitamina C + E aumentam o número de células totais em relação aos grupos não suplementados e controle. O efeito foi significativo após 4 HPI em peixes inoculados com A. hydrophila em comparação com aqueles que receberam vitamina C ou E. O mesmo ocorreu com trombócitos após 48 HPI.

Martins e cols. (³³33 Martins ML, Moraes FR, Fujimoto RY, Onaka EM, Bozzo FR, Moraes JRE. Carragenin induced inflammation in Piaractus mesopotamicus (Osteichthyes: Characidae) cultured in Brazil. Boletim do Instituto de Pesca. 2006; 32(1): 31-39.) examinaram os efeitos da suplementação dietética com 500 mg de vitamina C, associada à mesma concentração de vitamina E na inflamação aguda induzida por carragenina em pacus. Peixes suplementados tiveram maior acúmulo de células totais no local infamado, principalmente trombócitos em relação ao grupo não suplementado, corroborando os resultados atuais.

5. Conclusão

A suplementação com 500mg/kg de vitamina C e E em Pacus gerou maior acúmulo de células no sítio imunológico da inflamação em A. Hydrophila e, portanto, auxiliou o sistema vitamínico dessas espécies.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (04/13081-0 e 05/55788-5) e ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) pelo apoio financeiro. In Memoriam: Um Grande Amigo e Mentor, Professor Flávio Ruas de Moraes

References

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