Resumo

Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, uma videira encontrada no Brasil, tem sido correlacionada a surtos de intoxicações em bovinos e búfalos, gerando perdas econômicas relacionadas à morte por insuficiência cardíaca, aborto, natimorto e mortalidade neonatal. O objetivo deste estudo foi examinar o potencial embriotóxico do extrato vegetal aquoso em embriões bovinos in vitro. O estudo in vitro foi realizado em cinco repetições de cultura de embriões bovinos distribuídos em dois grupos: controle, meio de cultura de embriões in vitro sem o extrato aquoso da planta; grupo tratado, com adição de 2,7mg / mL de extrato vegetal aquoso (10%) à cultura do embrião no sexto dia de cultivo. A taxa de clivagem foi avaliada no dia 2 da cultura de células. Viabilidade, eclodibilidade e subdesenvolvimento de blastocistos no sétimo, oitavo e nono dia (D7, D8 e D9, respectivamente) de cultura foram avaliados em microscópio estereoscópico. No dia 7, os blastocistos foram submetidos ao ensaio TUNEL para determinar o índice apoptótico. Observamos redução significativa da produção de blastocisto / número de embriões clivados (60,6% vs 41,5%); redução da produção de blastocistos / número total de oócitos bovinos maturados (35,1% vs 21,3%); e taxas de eclosão embrionária (38,0% vs 10,0%). No entanto, nenhum efeito foi observado na taxa de apoptose. Em conclusão, o extrato aquoso das folhas de N. multiglandulosa reduz a viabilidade do embrião bovino in vitro, sugerindo possíveis efeitos prejudiciais no desenvolvimento embrionário.

Palavras-chave:
apoptose; blastocisto; planta tóxica

Abstract

Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa, a vine plant found in Brazil, has been correlated to outbreaks of poisoning in cattle and buffaloes, generating economic losses related to the death due to heart failure, miscarriage, abortion, stillbirth, and neonatal mortality. The aim of this study was to examine the embryotoxic potential of the aqueous plant extract on in vitro bovine embryos. In vitro study was performed in five replicates of bovine embryo culture assigned in two groups: control, in vitro embryo culture medium without the aqueous plant extract; treated group, with addition of 2.7mg/mL of aqueous plant extract (10%) to the embryo culture on the sixth day of culture. Cleavage rate was evaluated at day 2 of the cell culture. Viability, hatchability and underdevelopment of blastocysts on the seventh, eighth, and ninth days (D7, D8, and D9, respectively) of culture were assessed under stereoscopic microscope. On day 7, blastocysts were submitted to TUNEL assay to determine apoptotic index. In vitro exposure of bovine embryos to of N. multiglandulosa resulted in reduced embryo development and survival, evaluated by dark cytoplasm indicating poor morphology and poor quality with marked reduction of hatchability. We observed a significant reduction of blastocyst production/number of cleaved embryos (60.6% vs 41.5%); reduction of blastocysts production/total number of matured bovine oocytes (35.1% vs 21.3%); and embryonic hatching rates (38.0% vs 10.0%). However, no effects were observed on the apoptotic rate. In conclusion, aqueous extract of N. multiglandulosa leaves reduces bovine embryo viability in vitro, suggesting possible detrimental effects on embryo development.

Key words:
apoptosis; blastocyst; toxic plant

Introdução

Niedenzuella (Tetrapterys) multiglandulosa (A. Juss.) W. R. Anderson é uma planta tóxica da família Malpighiaceae encontrada nas regiões Sudeste e CentroOeste do Brasil(¹1 Mamede MCH, Sebastiani R, Almeida RF, Francener A, Amorim A. Malpighiaceae: lista de Espécies da Flora do Brasil [online]. Rio de Janeiro: Jardim Botânico do Rio de Janeiro; 2015, http://www.floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB155 [Acessed november 30, 2017].
http://www.floradobrasil.jbrj.gov.br/jab... ). O consumo espontâneo de folhas da Niedenzuella vem sendo associado a surtos de mortalidade, aborto, bezerros recém nascidos fracos, e falência cardíaca no gado(²2 Tokarnia CH, Peixoto PV, Döbereiner J, Consorte IB, Gava A.Tetrapterys spp. (Malpighiaceae), a causa de mortandades em bovinos caracterizadas por alterações cardíacas. Pesquisa Veterinária Brasileira. 1989;9, 23-44.,³3 Carvalho NM, Alonso LA, Cunha NG, Ravedutti, J, Barros CSL, Lemos RAA. Intoxicação de bovinos por Tetrapterys multiglandulosa (Malpighiaceae) em Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira. 2006;6, 139-146.), e a intoxicação frequentemente ocorre na estação seca devido à falta de foragens alternativas(³3 Carvalho NM, Alonso LA, Cunha NG, Ravedutti, J, Barros CSL, Lemos RAA. Intoxicação de bovinos por Tetrapterys multiglandulosa (Malpighiaceae) em Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira. 2006;6, 139-146.,⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.). Efeitos toxicológicos prejudiciais são frequentemente associados a outras causas, principalmente infecciosas. Perdas embriogênicas e abortos são um problema sério que resulta em considerável perda econômica para a indústria de carne bovina, e a eficácia das medidas de controle requerem diagnóstico acurato. Infelizmente, apenas 30% dos casos chegam a um diagnóstico etiológico definitivo, considerando que muitos agentes, infecciosos ou não, podem estar envolvidos(⁵5 Kirkbride CA. Etiologic agents detected in a 10-year study ofbovine abortions and stillbirths. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 1992;4, 175-180.,⁶6 Jamaluddin, AA, Case JT, Hird DW, Blanchard PC, Peauroi JR, Anderson ML. Dairy cattle abortion in California: evaluation of diagnostic laboratory data. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 1996;8, 210-218.). Pesquisas experimentais prévias determinaram que ovelhas também podem ser susceptíveis(⁷7 Riet-Correa G, Terra FF, Schild AL, Riet-Correa F, Barros SS.Intoxicação experimental por Tetrapterys multiglandulosa (Malpighiaceae) em ovinos. Pesquisa Veterinária Brasileira. 2005;25, 91-96.).

N. multiglandulosa também induz aborto em diferentes momentos da gestação e a ingestão da planta em fase de prenhez tardia resulta em natimortos ou nascimento de prole fraca(3,⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.,⁸8 Riet-Correa G, Riet-Correa F, Schild, AL, Barros SS, Soares MP. Abortion and neonatal mortality in sheep poisoned with Tetrapterys multiglandulosa. Veterinary Pathology. 2009;46, 960-965.). Os efeitos da planta durante os estágios iniciais do desenvolvimento embriogênico permanecem desconhecidos, pois estudos prévios foram realizados no terço médio ou final da prenhez(⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.,⁸8 Riet-Correa G, Riet-Correa F, Schild, AL, Barros SS, Soares MP. Abortion and neonatal mortality in sheep poisoned with Tetrapterys multiglandulosa. Veterinary Pathology. 2009;46, 960-965.). Em um surto que ocorreu em 2004 no Brasil, aproximadamente 80% de 290 vacas prenhas que haviam sido introduzidas em um pasto altamente infestado por N. multiglandulosa apresentaram aborto ou pariram bezerros fracos que morrem alguns dias após o nascimento, indicando que a substância tóxica pode ultrapassar barreiras placentárias(⁹9 Peixoto PV, Caldas SA, França TN, Peixoto TC, Tokarnia CH.Chronic Heart Failure and Abortion Caused by Tetrapterys spp. in Cattle in Brazil. In: RIET-CORREA, F. et al. (Eds.). Poisoning by plants, mycotoxins, and related toxins. [s.l.] CAB International: London, 2011. p. 256-263.). Na verdade, o aborto ainda é o aspecto prejudicial mais comumente reportado na intoxicação espontânea por N. multiglandulosa(³3 Carvalho NM, Alonso LA, Cunha NG, Ravedutti, J, Barros CSL, Lemos RAA. Intoxicação de bovinos por Tetrapterys multiglandulosa (Malpighiaceae) em Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira. 2006;6, 139-146.).

Apesar do potencial tóxico ao trato reprodutivo feminino, nós ainda não identificamos o mecanismo de ação dos compostos da N. multiglandulosa. Todas as partes da planta são tóxicas, como folhas jovens e maduras de N. multiglandulosa têm heterosídeos flavônicos, polifenóis, esteróides, e glicosídeos cardiotônicos. Além disso, taninos e alcalóides quartenários foram apenas encontrados em folhas maduras(¹⁰10 Melo MM, Dantas-Barros AM. Triagem fitoquímica preliminar da Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Revista Brasileira de Toxicologia. 1999.v.12, p.55-62.). Outro estudo isolou e identificou 19 diferentes compostos das folhas, incluindo alcalóides, flavonoides glicosilados e não-glicosilados, outros compostos glicosilados e seis esteroides (orecdisteróides)(¹¹11 Russo HM, Nunes WDG, Da Silva BV, Ionashiro M, Caires FJ. Thermo analytical and spectroscopic characteristics of young and old leaves powder and methanolic extracts of Niedenzuella multiglandulosa. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2018;132: 771-776.).

Os efeitos de um agente tóxico do desenvolvimento embriogênico e fetal dependem da sua natureza, dosagem, estágio de desenvolvimento, e fatores que modificam a toxicidade, como o genótipo (espécie/raça), ambiente materno, e a placenta. O período de desenvolvimento entre a fertilização e a implantação do embrião no útero e subsequente organogênese é conhecida como préimplantação, um estágio muito sensível à injúria que pode determinar a morte embrionária ou completa recuperação do desenvolvimento embriogênico(¹²12 Hood RD, Rousseaux CG, Blakley PM. Embryo and fetus. In: Haschek, WM, Rousseaux CG, Wallig MA. Editors. Handbook of Toxicologic Pathology, Cambridge: Academic Press; 2002.pp. 895-936.). Testagem da sensibilidade dos embriões a agentes químicos no período pré-implantação é essencial para determinar o seu potencial de induzir a letalidade embrionária. No entanto, existem poucos protocolos experimentais que estudaram a possível toxicidade de químicos a embriões bovinos.

Alternativamente, modelos in vitro vêm sendo utilizados como novas abordagens na abordagem da toxicologia reprodutiva(¹³13 Piersma AH, Bosgra S, van Duursen MB, Hermsen SA, Jonker LR, Kroese E.D, van der Linden SC, Man H, Roelofs MJ, Schulpen SH, Schwarz M, Uibel F, van Vugt-Lussenburg BM, Westerhout J, Wolterbeek AP, van der Burg B. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod Toxicol 2013; 38:53-64.), principalmente em mulheres expostas a determinados agentes tóxicos que podem causar efeito temporário negativo na qualidade de oócitos(¹⁴14 Woudenberg AB, Gröllers-Mulderij M, Snel C, Jeurissen N, Stierum R, Wolterbeek A. The bovine oocyte in vitro maturation model: a potential tool for reproductive toxicology screening. Reproductive Toxicology. 2012; 34:251-260.,¹⁵15 Santos RR, Eric J Schoevers EJ, Roelen BAJ. Usefulness of bovine and porcine IVM/IVF models for reproductive toxicology Reproductive Biology and Endocrinology. 2014; 12:117-128.). Durante a maturação, oócitos são susceptíveis a alterações epigenéticas interferindo na fertilização e desenvolvimento embrionário precoce. A possibilidade de uso de material bovino obtido em frigorífico para testes in vitro relacionados a gametas e desenvolvimento embrionário precoce parecem uma importante ferramenta para diminuir o número de testes in vivo(¹⁵15 Santos RR, Eric J Schoevers EJ, Roelen BAJ. Usefulness of bovine and porcine IVM/IVF models for reproductive toxicology Reproductive Biology and Endocrinology. 2014; 12:117-128.), e o uso de oócitos de bovinos fornecem informações sobre as possibilidades de avaliação de químicos na maturação de oócitos in vitro, fertilização e desenvolvimento embriogênico precoce (estágio de preimplantação)(¹⁵15 Santos RR, Eric J Schoevers EJ, Roelen BAJ. Usefulness of bovine and porcine IVM/IVF models for reproductive toxicology Reproductive Biology and Endocrinology. 2014; 12:117-128.,¹⁶16 Lorenzetti S, Altieri I, Arabi S, Balduzzi D, Bechi N, Cordelli E, Galli C, Letta F, Modina SC, Narciso L, Pacchierotti F, Villani P, Galli A, Lazzari G, Luciano AM, Paulesu L, Spano M, Mantovani A. Innovative non-animal testing strategies for reproductive toxicology: the contribution of Italian partners within the EU project Re ProTect. Annali dell'Istituto Superiore di Sanita. 2011; 47:429-444.).

Apesar dos numerosos relatos dos efeitos da intoxicação in vivo por N. multiglandulosa, a toxicidade direcionada ao sistema reprodutor continua incerta. Baseado em estudos prévios usando animais vivos e tentando replicar a mesma menor concentração tóxica da planta (0,002mg do extrato de planta/µL de sangue) que apresentava efeitos deletérios no trato reprodutivo de cabras(⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.) e coelhas(¹⁷17 Bull V. Efeito da Niedenzuella multiglandulosa em coelhas gestantes e em embriões bovinos produzidos in vitro. 2018. 57f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Universidade Federal de Minas Gerais.), o objetivo deste estudo foi determinar o efeito embriotóxico do extrato aquoso de folhas de N. multiglandulosa usando embriões bovinos in vitro como modelo.

Materiais e métodos

A pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG (CEUA) sob o protocolo 388/2016.

N. multiglandulosa (Malpighiaceae) foi cultivada e colhida no Campo de Plantas Tóxicas da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil. Um espécime voucher foi depositado no Herbário do Departamento de Botânica (Herbário BHCB), Instituto de Ciências Biológicas, sob o número BHCB 38051.

O extrato foi obtido a partir de 77g da planta, composto por 60% de folhas maduras, 24% de folhas jovens e 16% de brotos, a mesma proporção de diferentes partes das plantas utilizadas anteriormente em estudos realizados in vivo com intoxicação em caprinos(⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.) e coelhos(¹⁷17 Bull V. Efeito da Niedenzuella multiglandulosa em coelhas gestantes e em embriões bovinos produzidos in vitro. 2018. 57f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Universidade Federal de Minas Gerais.). Folhas e brotos foram triturados em liquidificador com 500mL de etanol absoluto (>99%). O material resultante foi deixado em repouso em um recipiente fechado por quatro dias em temperatura ambiente com reposição diária de álcool. A solução de álcool foi filtrada e concentrada em um evaporador rotativo a 65°C a 80 rpm sob vácuo para formar um extrato seco pesando 4,216g. Em seguida, 100mL de água destilada foram adicionados ao extrato e levados ao banho ultrassônico por 15 minutos para aumentar a extração dos constituintes fitoquímicos da planta. Posteriormente, o extrato aquoso foi separado por filtração usando um filtro de papel qualitativo. O extrato aquoso foi fracionado com 50mL de acetato de etila em um funil de separação. Após a descarga da fração de acetato de etila, o extrato aquoso remanescente foi fracionado mais duas vezes com 70mL de acetato de etila. O acetato de etila residual no extrato aquoso foi removido em um evaporador rotativo a 65°C a 100 rpm. A solução aquosa foi então fracionada três vezes com 50mL de butanol saturado em água em um funil de separação. O extrato aquoso foi novamente concentrado no evaporador rotativo a 68°C a 100 rpm, produzindo 1,545g de resíduo marrom seco. A temperatura utilizada no processamento laboratorial para obtenção do extrato foi baseada em estudos anteriores publicados(¹⁸18 Borboleta LR, Labarrere CR, Ribeiro AFC, Paes Leme FO, Paes PRO, Ocarino NM, Melo MM. Perfil bioquímico sanguíneo na intoxicação experimental com extratos de Mascagnia rigida (A. Juss.) Griseb. (Malpighiaceae) em coelhos. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2011;63:1113-1123.,¹⁹19 Pedroza H P, Ferreira, MG, Melo KDA, Carvalho JG, Keller KM, Melo MM, Soto-Blanco B. Concentrações de oleandrina nas folhas de Nerium oleander de diferentes cores da floração. Ciência Rural. 2015; 45:864-866,²⁰20 Botelho AFM, Santos-Miranda A, Joca HC, Mattoso CRS, Oliveira MS, Pierezan F, Cruz JS, Soto-Blanco B, Melo MM. Hidroalcoholic extract from Nerium oleander L. (Apocynaceae) elicits arrhythmogenic activity. Journal of Ethnopharmacology, 2017;12:170-177.). Um total de 27mg do extrato da planta foi diluído em 1mL de Meio Fluido de Oviduto Sintético (SOFaa) para testes in vitro.

Ovários bovinos (n = 403) foram obtidos em abatedouro local e os folículos foram aspirados para obtenção de oócitos para produção in vitro de embriões. Foram realizadas cinco rotinas de cultivo in vitro de embriões, considerando cada rotina como uma repetição e para cada repetição foram utilizadas cinco a seis replicatas. Todos os procedimentos para produção de embriões in vitro foram baseados em Leite et al.(²¹21 Leite AC, Andrade VB, Silva EBM, Borges AM. Efeito da adição do ácido linoleico conjugado no cultivo in vitro de embriões F1 Holandês x Zebu na sobrevivência pós-vitrificação. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2017;69 (6): 1385-1392.). Resumidamente, pequenos folículos ovarianos contendo oócitos imaturos foram puncionados para obter complexos cumulus-oócitos (COCs). Os CCOs imaturos foram submetidos à maturação in vitro (IVM) por 24 horas em meio à base de bicarbonato TCM-199 (Gibco® Life Technologies, Grand Island, EUA). Oócitos maduros circundados por um cumulus expandido foram submetidos à fertilização in vitro (FIV) por co-incubação com espermatozoides em meio FERTTALP por cerca de 18 horas. O dia da adubação foi considerado dia zero (D0). Após a FIV, os zigotos presumidos foram cultivados in vitro em meio SOFaa até D9.

No primeiro dia (D1), os zigotos foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos de cinco a seis gotas de cultura (réplicas) de meio de cultura para cada tratamento, contendo 15 a 20 estruturas em cada gota. O Grupo 1 (controle) foi composto por zigotos que receberam apenas meio de cultura de embrião (SOFaa), e o Grupo 2 recebeu extrato aquoso de N. multiglandulosa no sexto dia (D6). Um total de 7μL (10%) de meio de cultura in vitro foi removido e substituído por 7μL de extrato vegetal aquoso (compreendendo 0,2mg de extrato de N. multiglandulosa/ 70μL de gota de cultura), previamente diluído em meio SOFaa. No dia dois (D2) de cultura, a taxa de clivagem (número de zigotos clivados por número total de COCs) foi avaliada. No sexto dia (D6), foram avaliadas as taxas de produção de embriões/número total de oócitos e produção de embriões/número total de zigotos clivados e viabilidade embrionária. O número de embriões produzidos, viabilidade e eclodibilidade de todos os blastocistos foram avaliados no sétimo, oitavo e nono dias de cultivo (D7, D8 e D9, respectivamente). Para viabilidade, avaliou-se a cinética do desenvolvimento embrionário, considerando o estágio de desenvolvimento esperado no dia da avaliação e comparando os grupos. A taxa de eclosão foi considerada pela capacidade dos embriões em crescimento de romper a zona pelúcida durante D7, D8 e D9. No D7, em média, três blastocistos (nove blastocistos por grupo) foram removidos de cada tratamento para fixação em solução de formalina a 4% para ensaio TUNEL (Promega® Corporation, Wisconsin, EUA) de acordo com as instruções do fabricante para determinação do índice apoptótico. As amostras foram observadas em microscópio de fluorescência com aumento de 400x. O número total de células foi obtido pela observação das células coradas por Hoechst, que foram visualizadas em azul com filtro de 460nm. As células (blastômeros) em apoptose foram identificadas por fluoresceína, resultando em coloração verde e observadas com filtro de 520±20nm. O índice apoptótico foi calculado a partir da razão entre o número total de células e o número de células apoptóticas, utilizando o programa IMAGEJ (Versão 1.42e, 2008).

Os dados foram submetidos aos testes de Kolmogorov-Smirnov e Cochran-Barttlet para normalidade e homoscedasticidade, respectivamente. Taxa de clivagem, produção de blastocisto/clivado, produção de blastocisto/número total de oócitos em cultura, taxa de eclosão e taxas de apoptose celular foram avaliadas pelo teste exato de Fisher usando o software GraphPad Instat 3.0. O nível de significância foi estabelecido em 5%.

Resultados

Os efeitos de N. multiglandulosa na produção de blastocistos em D7 são mostrados na Tabela 1. A taxa de clivagem não diferiu entre os grupos experimentais (58% vs 51%), indicando que os oócitos apresentavam qualidade semelhante antes do início da produção de embriões. No entanto, a produção de embriões, de acordo com o número total de oócitos e o número de embriões clivados, foi significativamente reduzida após o tratamento com N. multiglandulosa. A taxa de eclosão também foi significativamente menor no grupo tratado.As taxas de eclosão embrionária foram de 38,0% (38/100) e 10,0% (6/60), para os grupos controle e extrato de N. multiglandulosa, respectivamente.

Além disso, os embriões do grupo extrato de N. multiglandulosa apresentaram morfologia ruim (citoplasma escuro) e qualidade inferior aos do grupo controle (Figura 1).

Figura 1
Embriões bovinos produzidos in vitro no dia 9 de cultivo. A1, B1 e C1: Grupo Controle; A2, B2 e C2: extrato aquoso de N. multiglandulosa; HB: blastocisto eclodido; EB: blastocisto precoce; BL: blastocisto; ZP: zona pelúcida após a eclosão do embrião (estereomicroscópico com aumento de 40X). B e C: Avaliação da apoptose de embriões bovinos in vitro (microscópio de fluorescência com aumento de 400X). B1 e B1: Total de células embrionárias bovinas coradas com Hoechst (azul) (filtro 460nm). B2 e C2: células verdes brilhantes (TUNEL) em apoptose (filtro 520±20nm).

O extrato aquoso de N. multiglandulosa não causou apoptose significativa de células embrionárias, pois o número de células apoptóticas e a taxa apoptótica permaneceram inalterados, conforme mostrado na Figura1 e na Tabela 2.

Discussão

Com base em estudos anteriores do nosso grupo usando animais vivos, e tentando replicar a mesma concentração mais baixa de planta tóxica (0,002mg de extrato vegetal/µL de sangue) que teve efeitos prejudiciais no trato reprodutivo de cabras gestantes(⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.) e coelhas(¹⁷17 Bull V. Efeito da Niedenzuella multiglandulosa em coelhas gestantes e em embriões bovinos produzidos in vitro. 2018. 57f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Universidade Federal de Minas Gerais.), propusemos testar uma dose única de extrato de planta (0,002mg de extrato de planta/µL de meio de cultura in vitro) para replicar a mesma concentração usada naqueles ensaios in vivo. Para atingir a concentração exata da planta tóxica nos baseamos nos métodos de Melo et al.(⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.) que testaram duas diferentes concentrações (10 e 20g/kg de peso corporal) de folhas de N. multiglandulosa. A concentração final de 0,2mg de extrato aquoso de N. multiglandulosa/70µL no meio de cultura embrionária foi relacionada à menor dose (10mg/Kg PC ou 380g de folhas verdes/cabra/dia) que teve efeitos reprodutivos negativos em cabras Saanen (média de 38kg de peso corporal). N. multiglandulosa apresentou 35% de matéria seca e os animais ingeriram, em média, 133g/dia de matéria seca (MS). Salienta-se que 1g de MS da planta equivale a 57,3mg de extrato, e 133g/dia x 57,3mg = 7.620,9mg de extrato (ingestão diária de extrato pelas cabras). Para caprinos com peso médio de 38kg (cabra = 38.000.000g) = 7.620,9mg de extrato por 38.000.000mg de PC = 0,0002 x 100 = ingestão de 0,02% do peso vivo em extrato.As cabras têm 8 a 10% do PC no sangue (3,04 a 3,80L de sangue) e 7.620,9mg de extrato em 3.000mL de sangue (3.000.000µL de sangue) = 0,002mg de extrato vegetal/µL de sangue. Os mesmos cálculos foram realizados pelo Bull(¹⁷17 Bull V. Efeito da Niedenzuella multiglandulosa em coelhas gestantes e em embriões bovinos produzidos in vitro. 2018. 57f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Universidade Federal de Minas Gerais.) utilizando coelhas prenhes (média de 3kg de PV; ingerindo 10,5g/dia de MS das plantas; 240 a 300mL de sangue; 0,002mg de extrato vegetal/µL de sangue).

Para o estudo in vitro no presente trabalho, usamos os mesmos cálculos. O extrato foi obtido a partir de 77g da planta (77g de planta verde x 35% de MS = 26,95g de MS) que fornece 1.545mg de extrato, e foram utilizados 27mg de extrato que foi diluído em 1.000 microlitros de meio de cultura de embrião = 27 mg/1.000 µL = 0,027 mg/microlitro de meio. 0,027mg/µL x 7µL que foi removido e recolocado em gota de cultura do meio de cultura (= 0,189 mg de extrato em 7µL). Uma gota de meio de cultura embrionário = 7µL do extrato + 63µL de meio de cultura = 70µL (10% do volume final). 0,189mg de extrato em gotas de 70µL do meio de cultura de embrião = 0,002mg/µL de meio de cultura. Finalmente, a mesma concentração de extrato vegetal foi usada para esses três ensaios diferentes usando cabras(⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.), coelhos(¹⁷17 Bull V. Efeito da Niedenzuella multiglandulosa em coelhas gestantes e em embriões bovinos produzidos in vitro. 2018. 57f. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal), Universidade Federal de Minas Gerais.) e bovinos produzidos in vitro embriões no presente estudo.

O dia 6 de cultivo foi escolhido para adicionar o extrato aquoso de N. multiglandulosa com base no estudo anterior de Melo et al.(⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.) que encontraram sinais precoces de toxicidade embrionária que acabaram levando à diminuição dos batimentos cardíacos, morte fetal, aborto, necrose de coagulação placentária e apoptose de células binucleares no epitélio trofoblástico, placentite e necrose de coagulação das áreas carunculares. Na produção de embriões in vitro, a diferenciação celular precoce (massa celular interna e formação de trofoblastos) ocorre em embriões por volta do dia 6 (blastocistos iniciais), e a diferenciação trofoblástica, responsável pela formação da placenta, é encontrada seis dias após a fertilização in vitro.

A ingestão de folhas de N. multiglandulosa induz aborto em diferentes fases da gestação, causando também natimortos ou nascimento de filhotes fracos(³3 Carvalho NM, Alonso LA, Cunha NG, Ravedutti, J, Barros CSL, Lemos RAA. Intoxicação de bovinos por Tetrapterys multiglandulosa (Malpighiaceae) em Mato Grosso do Sul. Pesquisa Veterinária Brasileira. 2006;6, 139-146.,⁴4 Melo MM, Vasconcelos AC, Dantas GC, Serakides R, Alza-mora F. Experimental intoxication of pregnants goats with Tetrapterys multiglandulosa A. Juss. (Malpighiaceae). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2001;53, 58-65.,⁸8 Riet-Correa G, Riet-Correa F, Schild, AL, Barros SS, Soares MP. Abortion and neonatal mortality in sheep poisoned with Tetrapterys multiglandulosa. Veterinary Pathology. 2009;46, 960-965.). No entanto, pouco se sabe sobre seus possíveis efeitos no desenvolvimento embrionário inicial. O resultado final do desenvolvimento embrionário inicial anormal é a morte e reabsorção, que geralmente não é detectada na clínica médica ou se apresenta como síndrome da vaca repetidora de cio induzida por estradiol(²²22 Panter KEE, Stegelmeier BL. Effects of xenobiotics and phytotoxins on reproduction in food animals. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 2011;27: 429-446.). O extrato de N. multiglandulosa foi tóxico durante os estágios iniciais da embriogênese bovina, pois causa subdesenvolvimento e baixa eclodibilidade dos embriões. Esses resultados sugerem que a planta tem potencial para promover morte embrionária e reabsorção em bovinos, semelhante ao relatado em ratos após a ingestão de Ateleia glazioviana(²³23 Langeloh, A, Leguizanón F, Dalsenter P. Potencial abortivo e infertilizante de plantas brasileiras contaminantes ocasionais de pastagens de bovinos e outros herbívoros de interesse econômico. Pesquisa Veterinária Brasileira. 1992; 12:11-18.).

Em condições naturais, a massa celular interna do embrião apresenta maior índice apoptótico, com baixa proporção no trofectoderma, que regula a população celular e remove o excesso de células danificadas, desnecessárias ou comprometidas no desenvolvimento na fase de blastocisto(²⁴24 Byrne AT, Southgate J, Brison DR, Leese HJ. Analysis of apoptosis in the preimplantation bovine embryo using TUNEL. Journal of Reproduction and Fertility. 1999; 117:97-105.). Em embriões bovinos morfologicamente normais, a apoptose ocorre a partir do estágio de 9-16 células e, na fase de mórula, 50% dos embriões apresentam pelo menos um núcleo em apoptose durante a análise de TUNEL. Blastocistos com menos de 100 células apresentam taxa apoptótica de 0-10%, caindo para 0-6% naqueles com mais de 100 células(²⁴24 Byrne AT, Southgate J, Brison DR, Leese HJ. Analysis of apoptosis in the preimplantation bovine embryo using TUNEL. Journal of Reproduction and Fertility. 1999; 117:97-105.). No presente estudo, o extrato afetou o desenvolvimento embrionário inicial, conforme verificado pela menor produção in vitro de embriões bovinos. No entanto, o mecanismo de ação ainda é incerto. O aumento da apoptose na patogênese da disfunção placentária também foi estudado em cabras gestantes envenenadas experimentalmente com N. multiglandulosa. A apoptose intensa durante a fase inicial da gravidez pode ser prejudicial para o desenvolvimento normal e função da placenta e pode ajudar a explicar a morte fetal e aborto observado após a ingestão de N. multiglandulosa(²⁵25 Campos PP, Vasconcelos AC, Melo MM. Apoptose no placentomo de cabras gestantes intoxicadas experimentalmente com cipó-preto - Tetrapterys multiglandulosa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2004;56:19-24.).

Toxinas, incluindo as fitotoxinas, podem induzir estresse oxidativo nas células e causar danos ao comprometer o DNA ou componentes proteicos e lipídicos(²⁶26 McConkey DJ. Biochemical determinants of apoptosis and necrosis. Toxicological Letters, 1998:99:157-168.,²⁷27 Allen RG, Tresini M. Oxidative stress and gene regulation. Free Radical Biology & Medicine. 2000; 28, 463-499.). Além disso, os efeitos na respiração mitocondrial induzida pela hipóxia e as alterações na homeostase do cálcio reduzem os níveis de ATP, comprometendo o desenvolvimento embrionário inicial e aumentando a perda celular in vivo e in vitro(²⁶26 McConkey DJ. Biochemical determinants of apoptosis and necrosis. Toxicological Letters, 1998:99:157-168.). Embriões com maior celularidade e viabilidade têm maior chance de implantação no útero(²⁸28 Van Soom A, Ysebaert M, De Kruif A. Relationship between timing of development, morula morphology and cell allocation to the inner cell mass and trophectoderm in in vitro produced embryos. Molecular Reproduction and Development. 1997; 47: 47-56.). Embriões com desenvolvimento tardio e menor poder de eclosão da zona pelúcida apresentam características degenerativas nos estágios iniciais da divisão do blastômero, impedindo seu desenvolvimento posterior. Este resultado pode ser verificado pela diferença entre os embriões do grupo extrato aquoso de N. multiglandulosa, que são morfologicamente escurecidos e de baixa qualidade quando comparados ao grupo controle, podendo prejudicar o sucesso da transferência embrionária e inviabilizar a gestação em condições in vivo.

A composição química do extrato das folhas de N. multiglandulosa foi previamente estudada por Russo et al.(¹¹11 Russo HM, Nunes WDG, Da Silva BV, Ionashiro M, Caires FJ. Thermo analytical and spectroscopic characteristics of young and old leaves powder and methanolic extracts of Niedenzuella multiglandulosa. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 2018;132: 771-776.) realizando um fracionamento usando MPLC-UV, e depois uma purificação mais precisa usando HPLC preparativa. Dezenove substâncias foram isoladas como alcalóides, flavonóides glicosilados e não glicosilados, compostos glicosilados e seis esteróides (também chamados de ecdisteróides), incluindo um novo ecdisteróide que foi identificado e elucidado por UHPLCTOF-HRMS e RMN. As substâncias isoladas foram identificadas como: trigonelina, triptofano, 4hidroxicinamamida, ácido p-cumárico 4-O-β-Dglicopiranosídeo, icarisídeo F2, luteoforol, ácido (E)-4hidroxicinâmico, (Z)-4-hidroxicinâmico ácido, integristerona A, epiecdisterona, kaempferol triglicosídeo ecdisterona, isorhamnetina triglicosídeo, ácido cinâmico, multiglandysterona, calonisterona e podecdisona B.

Certamente, todas as ferramentas de diagnóstico estudos de campo, sinais clínicos, patologia macro e microscópica, bem como identificação química de plantas e toxinas vegetais em amostras de animais - são essenciais para fazer um diagnóstico preciso, desenvolver estratégias de manejo intervenientes e melhorar o desempenho reprodutivo(²⁹29 Stegelmeier BL, Davis TZ, Clayton MJ. Plant-induced reproductive disease, abortion, and teratology in livestock. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2020; 36(3):735-743. doi: 10.1016/j.cvfa.2020.08.004..
https://doi.org/10.1016/j.cvfa.2020.08.0... ,³⁰30 Buroni F, Gardner DR, Boabaid FM, Oliveira LGS, de Nava G, López F, Riet-Correa F. Spontaneous abortion in cattle after consumption of Hesperocyparis (Cupressus) macrocarpa (Hartw.) Bartel and Cupressus arizonica (Greene) needles in Uruguay. Toxicon. 2020 Jul 15;181:53-56. doi: 10.1016/j.toxicon.2020.04.104. Epub 2020 Apr 28. PMID: 32353569.
https://doi.org/10.1016/j.toxicon.2020.0... ).

O resultado do estudo in vitro sugere que o extrato aquoso de N. multiglandulosa pode prejudicar a reprodução, muitas vezes silenciosamente, por danificar embriões em estágio inicial causando subdesenvolvimento, baixa capacidade de eclosão da zona pelúcida e possivelmente morte embrionária precoce. Assim, mais estudos são necessários para investigar os efeitos prejudiciais da N. multiglandulosa nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário. Este é o primeiro estudo preliminar usando um sistema de produção de embriões in vitro e sabemos que o conhecimento deste extrato é importante, e que mais trabalhos devem ser feitos dando continuidade a esta pesquisa. O presente estudo estabelece um modelo in vitro novo e prático para estudar o efeito de plantas tóxicas na reprodução de ruminantes.

Os efeitos prejudiciais de produtos químicos e tóxicos na fertilidade feminina foram testados usando modelos animais in vitro principalmente com oócitos de bovinos e suínos(¹⁴14 Woudenberg AB, Gröllers-Mulderij M, Snel C, Jeurissen N, Stierum R, Wolterbeek A. The bovine oocyte in vitro maturation model: a potential tool for reproductive toxicology screening. Reproductive Toxicology. 2012; 34:251-260.,¹⁵15 Santos RR, Eric J Schoevers EJ, Roelen BAJ. Usefulness of bovine and porcine IVM/IVF models for reproductive toxicology Reproductive Biology and Endocrinology. 2014; 12:117-128.,³¹31 Campagna C, Ayotte P, Sirard MA, Arsenault G, Laforest JP, Bailey JL. Effect of an environmentally relevant metabolized organochlorine mixture on porcine cumulus-oocyte complexes. Reproductive Toxicololgy. 2007; 23:145-152.,³²32 Sirard MA. Factors affecting oocyte and embryo transcriptomes. Reproduction Domestic Animals. 2012; 47:148-155.); como uma possibilidade de estudar um modelo para humanos. Os modelos in vitro vêm aumentando uma vez que o uso de animais para fins científicos está diminuindo nas pesquisas. Esses estudos estão se concentrando no efeito de toxinas e toxinas reprodutivas na maturação in vitro de oócitos, fertilização e estágio de pré-implantação de embriões iniciais. A qualidade dos oócitos é prejudicada quando as mulheres são expostas a agentes tóxicos durante a maturação(¹⁴14 Woudenberg AB, Gröllers-Mulderij M, Snel C, Jeurissen N, Stierum R, Wolterbeek A. The bovine oocyte in vitro maturation model: a potential tool for reproductive toxicology screening. Reproductive Toxicology. 2012; 34:251-260.), e se o oócito não seguir uma via apoptótica(¹⁵15 Santos RR, Eric J Schoevers EJ, Roelen BAJ. Usefulness of bovine and porcine IVM/IVF models for reproductive toxicology Reproductive Biology and Endocrinology. 2014; 12:117-128.), ainda há o risco de afetar a fertilização e o desenvolvimento embrionário subsequente, uma vez que os oócitos são suscetíveis a alterações epigenéticas(³²32 Sirard MA. Factors affecting oocyte and embryo transcriptomes. Reproduction Domestic Animals. 2012; 47:148-155.). Danos às células embrionárias e placentárias leva ao desenvolvimento e função anormais da placenta e pode explicar a morte fetal e o aborto observado após a ingestão de N. multiglandulosa(²⁵25 Campos PP, Vasconcelos AC, Melo MM. Apoptose no placentomo de cabras gestantes intoxicadas experimentalmente com cipó-preto - Tetrapterys multiglandulosa. Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2004;56:19-24.).

Conclusão

Em conclusão, a exposição in vitro de embriões bovinos a 2,7mg/mL de extrato aquoso de N. multiglandulosa causou uma redução acentuada no desenvolvimento embrionário e eclodibilidade, sugerindo que a planta pode causar danos aos embriões quando a exposição ocorre nos estágios iniciais da gestação. Além disso, o experimento confirma que embriões bovinos produzidos in vitro podem ser usados para investigar a toxicidade das plantas.

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