DOI: 10.1590/1089-6891v18e-40237
MEDICINA VETERINÁRIA
IDENTIFICAÇÃO DE Helicobacter spp. EM MUCOSAS GÁSTRICA E DUODENAL DE CÃES (Canis familiaris) UTILIZANDO A TÉCNICA DE WARTHIN-STARRY
IDENTIFICATION OF Helicobacterspp. ON GASTRIC AND DUODENAL MUCOSA OF DOGS (Canis familiaris) BY WARTHIN-STARRY TECHNIQUE
Fernanda Silva Kuszkowski1
Fernando Soares da Silva1
Neli Branco de Miranda1
Tiffany Christiny Emmerich da Silva1
Joelma Lucioli1*
1Universidade Regional de Blumenau, Blumenau, SC, Brasil.
*Autora para correspondência - dra.lucioli@gmail.com
Resumo
Bactérias do gênero Helicobacter spp. têm sido identificadas na mucosa gástrica de diferentes espécies de mamíferos, inclusive em caninos. Pacientes infectados têm gastrite histológica; no entanto, não são todos os portadores que apresentam sinais clínicos. O objetivo deste trabalho foi identificar as bactérias sugestivas de Helicobacter spp. pela impregnação pela prata e caracterizar as lesões histopatológicas observadas. Foram analisadas amostras de mucosas gástrica e entérica de 26 caninos. Para avaliação histopatológica, foi realizada avaliação qualitativa, na qual foram atribuídos escores de ausente (-) a acentuada (+++), considerando a densidade de bactérias espiraladas por campo (400x), presença de células inflamatórias e aglomerados linfoides. Dos 26 animais avaliados, 34,6% apresentaram positividade para helicobacteriose. A gastrite foi observada em 15,38% dos animais e a maior ocorrência de bactérias do gênero Helicobacter spp. foi observada em região de corpo/fundo gástrico (23%). Em nove amostras, seis de corpo/fundo gástrico e três de antro pilórico, foram observados aglomerados linfóides associados a Helicobacter spp. Por meio de Teste de Fisher, verificou-se associação positiva entre a presença de Helicobacter spp. e agregados linfoides (p<0,001). A infecção por Helicobacter spp. está associada com a presença de aglomerados linfóides em caninos.
Palavras-chave: bactéria espiralada; cães; estômago; histoquímica; intestino.
Abstract
Bacteria of the genus Helicobacterspp. have been identified on the gastric mucosa of different species of mammals, including canines. Infected patients have histological gastritis; however, not all the animals that carry the bacteria show clinical signs. The objective of this work was to identify the bacteria suggestive of Helicobacterspp. by impregnation by silver and to characterize the histopathological lesions observed. Qualitative evaluation was performed for histological analysis, in which scores from absent (-) to severe (+++) were attributed, considering the density of spiral bacteria per field (400x), presence of inflammatory cells, and number of lymphoid aggregates. Of the 26 animals evaluated, 34.6% presented positivity for helicobacteriosis. Gastritis was observed in 15.38% of the animals and a higher occurrence of bacteria of the genus Helicobacterspp. was observed in the gastric body/fundus region (23%). In nine samples, six from gastric body/fundus and three from antrum pylorus, lymphoid clusters associated with Helicobacterspp. were observed. Fisher's Test revealed a positive association between the presence of Helicobacterspp. and lymphoid aggregates (p<0.001). Infection by Helicobacterspp. is associated with the presence of lymphoid aggregates in canines.
Keywords: dogs; histochemstry; intestine; spiral bacteria; stomach.
Recebido em: 12 março de 2016
Aceito em: 16 maio de 2017
Introdução
Bactérias do gênero Helicobacter spp. têm sido observadas há mais de um século. Foram primeiramente consideradas da espécie Campylobacter spp. e, posteriormente, em 1989, como do gênero Helicobacter, pertencente à família Helicobacteraceae, da classe Epsilonproteobacteria(1). Estes organismos são Gram-negativos, microaerófilos, curvados ou em espirais, não-sacarolíticos, oxidase-positivos (em exceção de H. canis), catalase e urease-positivos, sendo esta última reação uma característica marcante do gênero(1-3).
Na mucosa gástrica, estas bactérias adaptaram-se a viver no meio ácido e passaram a produzir urease, que induz a produção de amônia e age como receptor de íons H+, propiciando o desenvolvimento de pH neutro no interior da bactéria. Com isso, a Helicobacterspp. é capaz de resistir à acidez gástrica(4).
A prevalência da infecção por helicobactérias em cães varia de 82% a 100%(5-7). Já foram identificadas H. felis, H. bizzozeronii, H. salomonis, H. rappini, H. heilmannii, H. canis, H. cynogastricus e H. marmotae. Em animais com gastrite foram isoladas H. felis, H. bizzozeronii e H. heilmannii, sendo a H. bizzozeronii a espécie mais prevalente em biópsias gástricas de cães(8,9). E embora estejam comumente associadas à mucosa gástrica, algumas espécies como H. canis podem colonizar também o trato hepatobiliar(6,10).
Em sua maioria, as espécies de Helicobacter spp. não possuem um reservatório animal ou ambiental específico. Seu hospedeiro principal é o ser humano; no entanto, já foram observadas em algumas outras espécies de mamíferos como cães, gatos, furões, primatas não humanos, suínos, golfinhos e guepardos(1,11,12).
Mesmo diante dos estudos até então realizados, a patogenicidade da Helicobacter spp. ainda é considerada incerta em doenças gastrointestinais nos animais. Há anos que bactérias desse gênero são encontradas em mucosa gástrica de cães, porém a relação entre as mesmas com a doença gástrica ainda é incerta(13). Segundo Quinn(2) e Barr e Bowman(3), as infecções causadas pela Helicobacterspp. em cães podem estar associadas a alterações inflamatórias, degeneração glandular e úlceras gástricas.
O H. pylori em humanos possui diversidade genotípica e todas as suas cepas são capazes de levar ao desenvolvimento de um processo inflamatório na mucosa gástrica, com mediadores e ocitocinas que podem causar resposta inflamatória em vários níveis no hospedeiro(4). Dessa forma, os sinais clínicos observados podem variar desde vômitos, anorexia, apetite depravado, eructação, dor abdominal e perda de peso e, em alguns casos, severo emagrecimento e diarreia(3,14,15). Na maioria dos casos, os animais infectados por helicobactérias são clinicamente saudáveis, tornando muitas vezes difícil a relação direta entre a causa e o efeito da doença clínica(15).
O objetivo deste trabalho é verificar a presença de bactérias do gênero Helicobacter spp. e identificar lesões histopatológicas na mucosa gástrica e duodenal de cães necropsiados no Hospital Escola Veterinário – FURB/Blumenau.
Material e Métodos
O presente estudo do tipo experimental transversal foi realizado com amostras de estômago e intestino de 26 cães, machos e fêmeas, necropsiados no Laboratório de Patologia Veterinária do Hospital Escola Veterinário – FURB/Blumenau, independente de histórico clínico associado ou não a distúrbios gastrointestinais. Foram coletadas amostras gástricas (corpo/fundo e antro pilórico) e intestinais (duodeno), fixadas em solução de formalina tamponada a 10%, por 24 horas. As amostras foram submetidas a preparo histológico de rotina e secções de três micrômetros (3 µm) de espessura, foram coradas por hematoxilina-eosina (HE) e Warthin-Starry (WS) modificado(16) para caracterização histológica e pesquisa de bactérias espiraladas, respectivamente. Utilizando-se microscópio óptico, as alterações histológicas e sua intensidade foram avaliadas de acordo com a presença de agregados linfocitários, intensidade do infiltrado inflamatório e o tipo de células inflamatórias presentes(17,18).
A intensidade do infiltrado inflamatório em cada uma das regiões estudadas foi avaliada de acordo com o seguinte escore proposto por Happonen et al.(17): (-) ausente, até 4 células inflamatórias; (+) discreto, 5 a 15 células inflamatórias; (++) moderado, 16 a 25 células inflamatórias; ou (+++) acentuado, mais de 26 células inflamatórias por campo visual. A mucosa gástrica foi considerada normal quando da presença de 0 a 4 linfócitos esparsos e ausência de até 4 neutrófilos e/ou eosinófilos, ausência de agregados linfocitários e sem alterações epiteliais. A gastrite foi classificada como discreta, quando infiltrado de 5 a 15 células inflamatórias; moderada, quando infiltrado de 16 a 25 células inflamatórias ou acentuada quando infiltrado igual ou superior a 26 células inflamatórias.
As lâminas submetidas à WS foram avaliadas quanto à morfologia e contagem de bactérias sugestivas de Helicobacter spp. presentes em cada uma das regiões analisadas, levando-se em conta a distribuição da mucosa gástrica e duodenal, em três campos visuais aleatórios e com objetiva de 100x. A intensidade da colonização bacteriana seguiu o escore demonstrado no Quadro 1.
O teste Exato de Fisher foi utilizado para verificar se a presença de Helicobacterspp. estava associada à formação de aglomerados linfoides, congestão e infiltrado inflamatório. Considerando um nível de significância de p ≤ 0,05.
Resultados e Discussão
Ao todo foram coletadas 78 amostras de tecidos, sendo 26 de corpo/fundo gástrico, 26 de antro pilórico e 26 de duodeno, que foram fixadas em solução formalina a 10% por 24 horas e coradas pelas técnicas de HE e WS.
Não foram observadas alterações macroscópicas em nenhuma das amostras de estômago e intestinos coletadas. Entretanto, por meio da histopatologia foram observados agregados linfocitários em 23% (6/26) das amostras de corpo/fundo gástrico e em 11,5% (3/26) de antro pilórico; congestão de intensidade variando de discreta a moderada em 19,2% (5/26) das amostras de corpo/fundo gástrico e em 7,7% (2/26) de antro pilórico e infiltrado linfoplasmocitário multifocal discreto em 11,5% (3/26) das amostras de corpo/fundo gástrico e moderado em 3,8% (1/26) de antro pilórico. Nas amostras de duodeno foi observada congestão moderada e infiltrado linfoplasmocitário difuso moderado em 11,5% (3/26) das amostras analisadas (Figura 1).
Por meio de WS, nove amostras (34,6%) apresentaram positividade para helicobacteriose. Bactérias espiraladas foram visualizadas na camada superficial de muco e superfície do epitélio glandular, nas regiões gástricas de corpo/fundo (6/26), antro pilórico (3/26) e em duodeno (1/26), conforme demonstrado na Tabela 1.
Tais achados vão de encontro aos observados em outras pesquisas que afirmam que essa bactéria atinge normalmente a camada de muco que recobre a mucosa do estômago em epitélio superficial e criptas gástricas(8) e interior de glândulas(8,10). Destacamos ainda que as estruturas alongadas ao serem visualizadas em objetiva de maior aumento (100x) demonstravam conformação espiralada, compatível com Helicobacterspp.
A colonização das mucosas gástrica e entérica pela Helicobacter spp. foi classificada como sendo leve em 14,4% (4/26) das amostras de corpo/fundo gástrico, 7,7% (2/26) de antro pilórico e 3,8% (1/26) de duodeno. Em 7,6% (2/26) das amostras de corpo/fundo gástrico e 3,8% (1/26) de antro pilórico, foram visualizadas mais de 16 bactérias espiraladas por campo visual, caracterizando assim a colonização acentuada (Figura 2). Assim como Moutinho e colaboradores(7), que observaram um maior número de bactérias do gênero Helicobacter spp. em região do corpo (62%) e fundo gástrico (82%), a maior ocorrência de bactérias do gênero Helicobacterspp. no presente estudo foi nessa região, representando 23% (6/26) das amostras avaliadas. Já em região de antro pilórico foi observado que 11,5% (3/26) das amostras apresentavam a bactéria. A existência de bactérias espiraladas na mucosa gástrica pode não estar correlacionada com doenças digestivas do animal(19,20), podendo, entretanto, ser uma fonte de disseminação dessas bactérias. A falta de sinais clínicos e lesões macroscópicas evidentes em caninos infectados nos levam a crer que a bactéria não seja tão patogênica para esses como são para os felinos, em que as lesões se assemelham às observadas em humanos.
A região de corpo/fundo gástrico foi a mais acometida por lesões histopatológicas e também onde foram localizadas com maior frequência estruturas espiraladas, morfologicamente identificadas como Helicobacter spp, pela Técnica de Warthin-Starry, resultados esses que corroboram os achados de Handt et al.(21).
Na Tabela 2 é possível confrontar as alterações histopatológicas observadas nos fragmentos de corpo/fundo gástrico, antro pilórico e duodeno com a presença de estruturas espiraladas compatíveis com Helicobacter spp. em diferentes intensidades de colonização. Nove cães apresentaram pelo menos um aglomerado linfoide e não mais que cinco em pelo menos uma região gástrica e em nenhum destes foi observado, de maneira associada, infiltrado inflamatório em mucosa. Entretanto, associado aos aglomerados linfoides, observou-se que seis animais apresentaram colonização leve e três, colonização acentuada de Helicobacter spp. A gastrite foi observada em apenas 15,38% (4/26) animais do nosso estudo, sendo que em 11,5% (3/26) dos casos era leve e em 3,84% (1/26) moderada. Em nenhum dos animais que apresentaram gastrite foram evidenciadas bactérias associadas. De acordo com Ülgen et al.(22), não há relação entre carga bacteriana, sintomas clínicos e presença de Helicobacter spp. na mucosa gástrica, o que dificulta a avaliação da relação helicobacteriose e gastrite, permanecendo incerto seu significado patogênico, provavelmente associado à dependência da relação cepa e hospedeiro(19). Estudos apontam a presença de Helicobacter spp. na saliva de cães com gastrite, o que indica que a saliva é uma potencial fonte da bactéria(23,24). Apesar de não totalmente elucidado, suspeita-se que a infecção entre outros animais e seres humanos ocorra por via oral como, por exemplo, por meio de lambedura(24, 25).
Dos sete animais que apresentaram infiltrado inflamatório do tipo linfoplasmocitário, em apenas um evidenciaram-se bactérias do gênero Helicobacterspp. e estas estavam localizadas no segmento duodeno.
Em relação aos aglomerados linfoides, em nosso estudo estes foram observados em nove amostras gástricas, sendo 06/26 de corpo/fundo gástrico e 3/26 de antro pilórico e, nessas amostras, por meio da técnica de WS, foram evidenciadas estruturas espiraladas compatíveis com Helicobacter spp. Por meio de Teste de Fisher, observou-se uma associação positiva entre a presença de Helicobacter spp. e agregados linfoides (p<0,001), o que corrobora com os achados de Handt et al.(21) e Mysorekar et al.(26), que afirmaram que a hiperplasia de nódulos linfoides representa uma resposta local à presença da Helicobacter spp. Esse sim é um importante achado histopatológico, indicativo de comprometimento da mucosa gástrica diante da bactéria. Entretanto, nossos achados são controversos aos de Takemura et al.(9), que em estudo semelhante constatou que existe associação entre os aglomerados linfóides e a helicobacteriose em felinos, mas não em caninos, e aumento da proliferação celular em ambas as espécies.
Conclusões
Com base nos achados, fica evidente a associação entre a presença de bactérias e a formação dos aglomerados linfoides, o que representa uma resposta local do tecido diante do agressor. Mesmo assintomáticos, cães podem apresentar bactérias espiraladas em mucosa gástrica e duodenal, podendo, dessa forma, se comportarem como um importante reservatório e disseminador da bactéria para outros animais e até mesmo para humanos. Esse fato demanda uma especial atenção ao estudo do modo de transmissão da helicobacteriose entre espécies, visto que representa uma importante questão relacionada à saúde pública.
Agradecimento
Ao Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica – PIBIC/FURB, pela bolsa de Iniciação Científica concedida.
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