AVALIAÇÃO DA NECESSIDADE DO TEMPO DE
EQUILÍBRIO NO CONGELAMENTO DE SÊMEN CAPRINO
Paula Letícia Nemes Schawb Gomes¹; Leandro Cavalcante Lipinski²;
Raimundo Jorge Teles de Araújo Pereira³
¹ Acadêmica do 8º período do curso de
Medicina Veterinária do CESCAGE - Centro de Ensino Superior dos Campos Gerais,
Ponta Grossa - PR, Brasil. CEP: 84010-410.
² Professor
Adjunto do curso de Medicina Veterinária do CESCAGE – Centro de Ensino Superior
dos Campos Gerais, Ponta Grossa – PR, Brasil.
³ Professor
Titular e Coordenador do curso de Medina Veterinária do CESCAGE - Centro de
Ensino Superior dos Campos Gerais, Ponta Grossa - PR, Brasil.
E-mail: rjtapereira@yahoo.com.br, raimundo@cescage.edu.br (autores correspondentes)
PALAVRAS-CHAVE: Criopreservação, espermatozóides,
pequenos ruminantes.
ABSTRACT
ASSESSMENT OF
EQUILIBRATION TIME IN THE FREEZING OF GOAT SEMEN
The process
of cryopreservation causes a marked decrease in sperm viability. Essential
measures are followed to prevent changes in sperm cells during freezing, such
as the cooling of semen to 5ºC before
the freezing process. This study evaluates the effect of equilibration periods
on quality of frozen goat semen. A total of 8 semen samples from one adult
goat were collected by artificial vagina and cryopreservated. The experiment was
performed in two stages: Group A – semen cooling to +5°C at 0,25 °C/min
(equilibration time of 1 hour), and semen freezing to -120°C at 0,25°C/min;
Group B – same cooling and freezing phases, but without the equilibration
period (Group B). Analysis of progressive motility revealed that the
equilibrium time at 5ºC is unnecessary for cryopreservation of goat semen due
to the fact that both groups showed a MIP of 65% after thawing.
KEYWORDS:
Cryopreservation, small ruminants, sperm
INTRODUÇÃO
O sêmen caprino pode ser usado a fresco, resfriado ou
congelado. Tanto o sêmen fresco bem como o resfriado apresentam fertilidade
mais elevada, quando comparados ao congelado (SALAMON & MAXWELL, 2000),
contudo o caprino por tratar-se de uma espécie que apresenta estacionalidade
reprodutiva a utilização do sêmen em estado fresco ou resfriado pode ficar
limitado a determinados períodos do ano. Já o sêmen criopreservado por ser
mantido por um longo período armazenado em nitrogênio líquido, apresenta maior
aplicabilidade (TRALDI, 2006).
O sêmen caprino foi inicialmente congelado por SMITH &
POLGE (1950), cujos autores registraram uma baixa fertilidade
pós-descongelação, o que limitava a sua utilização prática, sendo, portanto
motivo de muitas investigações no âmbito da criopreservação em todas as etapas
envolvidas no processo (LEBOEUF et al., 2000).
O tempo de equilíbrio é considerado o tempo total em que
os espermatozóides são mantidos em contato com o glicerol e todos os demais
componentes do diluidor, previamente à congelação (BITTENCOURT et al., 2006).
Durante esse período, ocorre o equilíbrio osmótico entre o meio intracelular
espermático e extracelular, formado por todos os componentes osmoticamente
ativos presentes no meio diluidor (SALAMON & MAXWELL, 2000). Segundo OETTLÉ
(1986), um apropriado período de equilíbrio, assim como adequadas taxas de
diluição e resfriamento celular, são fatores fundamentais para a prevenção do
surgimento de alterações espermáticas durante o processo de criopreservação
espermática, além do que uma otimização dos processos iniciais de
pré-congelação pode aumentar os índices de viabilidade espermática
pós-descongelação.
A inseminação artificial é
considerada a mais antiga biotécnica da reprodução promovendo notáveis ganhos
genéticos no melhoramento dos animais domésticos. O uso do sêmen congelado apresenta inúmeros
benefícios como o melhor aproveitamento de reprodutores, facilidade no comércio
e transporte de material genético superior, permitindo assim a introdução de
novas linhagens no rebanho com maior segurança sanitária, preservação de
genética diferenciada entre outras vantagens (SALAMON & MAXWELL, 1995).
O objetivo deste trabalho foi avaliar a necessidade do uso
do tempo de equilíbrio a 5ºC antes do inicio da curva negativa de congelação de
sêmen caprino.
MATERIAIS E MÉTODOS
O presente trabalho foi desenvolvido no laboratório de
andrologia do Centro de Biotecnologia de Reprodução Animal do CESCAGE,
localizado na cidade de Ponta Grossa-PR, durante o período de novembro a
dezembro de 2008. Neste estudo foi utilizado 01 reprodutor da raça Boer, com
idade de 04 anos e fertilidade comprovada. Foram realizadas 08 coletas de sêmen
em dias alternados. O reprodutor foi mantido em pastagem de Aruana, com água e
sal mineral ad libitum, além da
suplementação de 0,4kg/dia de concentrado comercial com 18% PB e feno de
Tifton. As coletas do sêmen foram realizadas utilizando uma vagina artificial,
tendo como manequim uma cabra com estro induzido ou natural.
Imediatamente após a coleta, o sêmen
foi mantido em banho maria numa temperatura de 37ºC para realização dos exames
físicos (volume, cor e aspecto) e microscópico (turbilhão, vigor e motilidade
progressiva). O turbilhonamento foi avaliado pela deposição de uma gota do
sêmen sobre a lâmina aquecida observando-se movimentos de onda em escala de 0 a
5. A motilidade progressiva-MIP (0 a 100%) e o vigor (0 a 5) foram observados
pela deposição de uma gota de sêmen diluído entre lâmina e lamínula com
objetiva de 200x, de acordo com o indicado pelo Colégio Brasileiro de
Reprodução Animal (CBRA) (HENRY & NEVES 1998). A determinação da
concentração espermática foi feita com o auxílio da câmara de Neubauer,
utilizando-se sêmen numa diluição de 1:400 em solução de formol-salina tamponada
(SALAMON & MAXWELL, 2000).
O sêmen foi diluído em
TRIS-GEMA-GLICEROL a 7%, sendo imediatamente envasado em palhetas de 0,25ml,
lacradas com álcool polivinílico, numa dose inseminante de 100x106 espermatozóides/ml.
Todo o processo de congelamento foi realizado na maquina TK3000®,
feito em duas etapas, sendo a primeira etapa referente à curva positiva
(resfriamento a 0,25ºC/min. até alcançar +5º C) e a segunda etapa referente à
curva negativa (congelamento a partir de +5º C numa velocidade de 0,25%/min.
até atingir -120ºC). Para avaliar a influência do tempo de equilíbrio foram
conduzidos 02 grupos experimentais: Grupo A – O sêmen resfriado foi mantido em
equilíbrio por 1 hora na temperatura de +5ºC, para então ser colocado na curva
negativa e o Grupo B – O sêmen foi colocado diretamente na curva negativa sem
fazer uso do tempo de equilíbrio. A descongelação em ambos os grupos estudados
foi realizada em banho Maria a 37ºC por 20 segundos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Desde o primeiro registro do
congelamento de sêmen caprino, realizado por SMITH & POLGE (1950), quando
esses autores já reportavam baixos índices de fertilidade pós-descongelação,
muitos estudos têm sido desenvolvidos sobre a criopreservação do sêmen caprino
e todas as etapas envolvidas no processo (LEBOEUF et al., 2000). Neste contexto
muitas investigações têm sido desenvolvidas para avaliar o efeito do tempo de
equilíbrio sobre a qualidade espermática pós descongelação. Embora OETTLÉ
(1986) tenha indicado que um apropriado período de equilíbrio, assim como
adequadas taxas de diluição e resfriamento celular, são fatores fundamentais
para a prevenção do surgimento de alterações espermáticas durante o processo de
criopreservação espermática, os resultados apresentados na literatura sobre a
influência do período de equilíbrio sobre os índices de motilidade espermática
pós descongelação são bastante conflitantes, cuja influência tem variado de
1hora entre os trabalhos analisados. WESTHUYSEN (1978) verificou que maiores
tempos de equilíbrio proporcionaram melhores índices de motilidade pós
descongelação quando comparado a períodos de equilíbrio inferiores. Enquanto
que SINHA et al. (1992) obtiveram os melhores resultados de motilidade
espermática pós descongelação, utilizando um tempo de equilíbrio (TE) de 4h, DAS
& RAJKONVAR (1993) e DAS & RAJKONVAR (1995) observaram que o sêmen
mantido por 3h em TE obteve melhores índices de motilidade pós descongelação,
em relação ao sêmen submetido a 1h de TE. Já BITTENCOURT et al. (2006)
observaram que o tempo de equilíbrio de 2h (G2) foi o que obteve os melhores
índices de viabilidade espermática pós descongelação. Discordando com todos os
resultados da literatura, BARUAH et al. (2003) não verificaram diferenças
significativas em relação às taxas de motilidade espermática e lesões
acrossomais, para as amostras de sêmen equilibradas por 0,5, 1 e 1,5h. Estes
resultados foram corroborados pelos encontrados no presente estudo, quando
observamos uma similaridade nos índices de motilidade progressiva de 65% em
ambos os grupos estudados, tanto sem utilização de tempo de equilíbrio bem como
com um tempo de equilíbrio de 1h. Este resultado pode ser explicado diante do
fato de que os diversos trabalhos apresentados na literatura utilizam
diferentes metodologias, o que poderia interferir diferentemente nos resultados
encontrados, além do que o tempo de equilíbrio a que os espermatozóides devem
ser mantidos depende tanto da taxa de resfriamento que o sêmen será submetido
previamente à congelação (SALAMON & MAXWELL, 1995), bem como da composição
da fonte de açúcar presente no diluidor e da concentração de glicerol utilizada
(LIGHTFOOT & SALAMON, 1969).
CONCLUSÕES
Os resultados deste estudo indicam ser desnecessário a
utilização de tempo de equilíbrio na temperatura de 5ºC antes do início da curva
negativa de congelação.
A não utilização do tempo de
equilíbrio na congelação de sêmen caprino implica diretamente numa otimização
do tempo disponibilizado durante todo o processo reduzindo em pelo menos 1 hora
de trabalho empregado.
REFERÊNCIAS
BARUAH, C.K.;
BISWAS, R.K.; DEKA, B.C.; BORGOHAIN, B.N. Effect of glycerol equilibration
periods on quality of frozen semen in Beetal x Assam local crossbred goats. Indian Veterinary Journal, Madras, v. 80, n. 8, p. 763-765, 2003.
BITTENCOURT, R. F., RIBEIRO FILHO, A.
L., ALVES, S. G. G., BISCARDE, C. E., VASCONCELOS, M. F., OBA, E. O efeito do tempo de equilíbrio sobre a
qualidade do sêmen caprino criopreservado. Revista Brasileira de Saúde e
Produção Animal, Salvador, v. 7, n. 1, p. 27-37, 2006.
DAS, K. K.;
RAJKONWAR, C. K. A study on the characteristics of Beatal buck semen and its
freezability. Journal of Veterinary Physiology and Allied Sciences, Izatnagar,
v. 12, n. 2, p. 6-16, 1993.
DAS, K. K.;
RAJKONWAR, C. K. Effects of equilibration periods on the motility of frozen
buck semen in raffinose egg yolk glycerol extender. Indian Journal of Animal
Research, Haryana, v.29, n.2, p.141-144, 1995.
HENRY, M.;
NEVES, J. P. Manual para exame andrológico e avaliação de sêmen animal. 2.ed. Belo Horizonte: Colégio
Brasileiro de Reprodução Animal, p.49, 1998.
LEBOEUF, B.;
RESTALL, B.; SALAMON, S. Production and storage of goat semen for artificial
insemination. Animal Reproduction Science, Amsterdam, v.62,
p.113-141, 2000.
LIGHTFOOT, R.
J.; SALAMON, S. Freezing of ram semen by the pellet method. II. The effect of
method of dilution, dilution rate, glycerol concentration, and duration of
storage at 5°C prior to freezing on survival of spermatozoa. Australian
Journal of Biological Science, Melbourne, v. 22, p. 1547-1560, 1969.
OETTLÉ, E. E.
Changes in acrossome morphology during cooling and freezing of dog semen. Animal
Reproduction Science, Amsterdam, v. 12, p. 145-150, 1986.
SALAMON, S.,
MAXWELL W. M. C. Storage of ram semen. Animal
Reproduction Science, Amsterdam, v. 62, p. 77-111, 2000.
SALAMON, S.;
MAXWELL, W. M. C. Frozen storage of ram semen. I. Processing, freezing, thawing
and fertility after cervical insemination. Animal Reproduction Science, Amsterdam,
v. 37, p. 185–249, 1995.
SINHA, S.;
DEKA, B. C.; BORGOHAIN, B. N.; TAMULI, M. K. Study on freezing of goat semen in
skim milk extender with different glycerol levels and equilibration periods. The
Indian Journal of Animal Sciences, New Delhi, v. 13, n. 1, p. 38-41,
1992.
TRALDI A. S. Biotécnicas aplicadas em
reprodução de pequenos ruminantes. In: FEINCO 3, 2006.
WESTHUYSEN,
J. M. VAN DER. Observations on the deep-freezing of
Angora goat semen. South African Journal of Animal Science, Pretoria,
v. 8, n. 2, p. 111-113, 1978.