EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO IN VITRO DE SELÊNIO SOBRE A PRODUÇÃO INTRACELULAR DE PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO EM CÉLULAS POLIMORFONUCLEARES DE BOVINOS: IMPLICAÇÕES NA RESISTÊNCIA À MASTITE

Fernando N. Souza¹, Maiara G. Blagitz², Andréia O. Latorre³, Camila Silano⁴, Kátia A. Souza⁴, Glauco D. Glütler⁴, Camila F. Batista¹, Clara S. Mori³, Maria Claudia A. Sucupira³, Alice M.M.P. Della Libera¹

1.     Médico Veterinário, mestrando, Laboratório de Imunodiagnóstico do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, São Paulo- SP, Brasil.

CEP 05508-270. E-mail: nogueirasouza@usp.br (autor correspondente)

2.     Médica Veterinária, doutoranda, Laboratório de Imunodiagnóstico do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo

3.     Médica Veterinária, doutoranda, Laboratório de Farmacologia e Toxicologia do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.

4.     Acadêmicos do Curso de Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo

5.     Química, Laboratório de Doenças Nutricionais e Metabólica do Departamento de Clínica Médica da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo

6.     Médicas Veterinárias, doutoras, professoras do curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo

PALAVRAS-CHAVES: Citometria de fluxo, glândula mamária, neutrófilos, resposta imune.

ABSTRACT

EFFECT OF IN VITRO SELENIUM SUPPLEMENTATION ON INTRACELLULAR HYDROGEN PEROXIDE PRODUCTION BY BOVINE POLYMORPHONUCLEAR LEUKOCYTES: IMPLICATIONS FOR MASTITIS CONTROL

This study evaluates the effect of in vitro selenium supplementation on intracellular hydrogen peroxide production by bovine polymorphonuclear leukocytes of dairy cows. Thus, a total of 16 blood and milk samples were collected. Cells were then incubated with 50µM 2',7' dichlorodihydrofluorescein diacetate for 30 minutes at 37º C. After selenium supplementation, evidence showed sodium selenite at concentrations of 0-10 µM. Results revealed an increase in reactive oxygen species production of polymorphonuclear cells, which may lead to the enhancement of mammary gland immunity.

KEYWORDS: Flow cytometry, immune response, mammary gland, neutrophils.

INTRODUÇÃO

A mastite não é apenas a doença de maior impacto na pecuária leiteira mundial, mas é também a principal enfermidade que afeta a indústria de laticínios comprometendo a segurança alimentar e qualidade do leite associados aos resíduos de antimicrobianos e às altas contagens de células somáticas.

Logo após a entrada do patógeno na mama, os macrófagos juntamente com as células epiteliais iniciam o processo inflamatório em resposta a necessidade de eliminação do agente invasor através da produção e liberação de citocinas que resulta na migração de células polimorfonucleares (PMN), principalmente neutrófilos, do sangue para a glândula mamária, conferindo assim a primeira linha de defesa contra patógenos. Estas células atuam na eliminação da infecção pela fagocitose e pela capacidade microbicida dada pela explosão respiratória resultante da produção intracelular de espécies reativas de oxigênio, entre elas o peróxido de hidrogênio (PAAPE et al., 2003).

Nos últimos anos, na tentativa de diminuir o impacto da mastite e a utilização de antimicrobianos em fazendas leiteiras, grandes esforços foram realizados na tentativa de aumentar os mecanismos de defesa da glândula mamária. Neste contexto, estudos apontaram para a redução dos casos de mastite e da contagem de células somáticas em animais suplementados com selênio (Se) (HOGAN et al., 1993; HEMINGWAY et al., 1999; SALMAN et al., 2009). Porém, poucos são os estudos que tentaram elucidar os mecanismos pelos quais este elemento atua.

O Se apresenta importante participação no sistema imune, além de conferir proteção contra as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. O primeiro relato que demonstrou o envolvimento deste elemento na resposta imune é datado de 1959, onde foram encontradas maiores concentrações deste elemento em tecidos com significante importância imunológica como o baço, os linfonodos e o fígado. Várias das ações no sistema imune do Se já descritas citam a participação das selenoproteínas, merecendo destaque neste contexto a glutationa peroxidase 1 (GSH-Px1). Esta enzima participa do sistema antioxidante convertendo o peróxido de hidrogênio em compostos menos tóxicos. Ademais, mais de 50 proteínas têm sido relacionadas a este elemento em várias espécies. No entanto, os efeitos diretos de compostos do Se não podem ser excluídos (McKENZIE et al., 1998).

Assim, o presente estudo objetivou investigar o efeito da suplementação in vitro de selênio sobre a capacidade microbicida de células PMN do sangue e da mama de bovinos.

MATERIAIS E MÉTODOS

No presente estudo foram utilizadas 16 amostras de sangue e 16 amostras de leite de vacas em lactação oriundas de propriedade localizada no Estado de São Paulo. Foi colhida uma amostra de sangue heparinizado de cada animal, e no mínimo 50 ml de leite de cada quarto mamário diluído na proporção 1:1 em solução salina tamponada (SST), e então mantidos a 4º C.

As amostras de leite foram submetidas à centrifugação a 1000 g por 10 minutos, sendo descartado o sobrenadante e retirada a camada de gordura. O botão celular resultante foi resuspendido em 30 ml de SST, e centrifugados novamente a 400g por 10 minutos. Posteriormente, o botão celular foi novamente resuspendido em 500 µL de RPMI-1640 contendo 10% de soro fetal bovino. Finalmente, foi realizada a contagem celular em câmara de Neubauer e avaliada a viabilidade celular pela exclusão do azul de Trypan.

A produção intracelular de peróxido de hidrogênio se deu pela utilização de 100 µL de sangue de cada animal e 2 x 10⁵ células viáveis do leite de cada quarto mamário que foram incubados a 37º C por 30 minutos com 50µM de 2´,7´ diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCFH-DA). Para avaliação do efeito da suplementação de Se foi adicionado ao meio de cultura celular, solução de selenito de sódio (Na₂O₃Se) resultando na concentração final de 0 µM (basal) e 10 µM de Na₂O₃Se.

            As amostras foram, então, analisadas por citometria de fluxo, onde 30.000 eventos foram adquiridos. A população de células PMN foi identificada pela sua característica de tamanho e granulosidade dada pela citometria de fluxo. A porcentagem de células que produziram peróxido de hidrogênio, assim como a intensidade da produção de intracelular de peróxido de hidrogênio, em valores arbitrários, foram dadas pela análise no programa FlowJo Tree Star Software^®.

A análise estatística foi realizada utilizando o programa GraphPad Prisma 5.0 (GraphPad Software, USA) utilizando o teste t para amostras pareadas.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados demonstraram maior produção intracelular de peróxido de hidrogênio pelos leucócitos PMN sangüíneos e lácteos das amostras suplementadas in vitro com 10 µM de selenito de sódio. As amostras sangüíneas apresentaram valores médios arbitrários de 422,14 (+ 143,48) e 935,03 (+ 490,97) (p = 0,0001) para as amostras sem e com suplementação, respectivamente. Os leucócitos PMN provenientes das amostras lácteas apresentaram valores médios arbitrários de produção intracelular de peróxido de hidrogênio de 28,46 (+ 15,17) e 40,75 (+ 19,15) (p = 0,0001) para as amostras sem e com suplementação com selenito de sódio, respectivamente. A porcentagem de PMN que produziram peróxido de hidrogênio no sangue foi de 99,63 % (+ 0,42) e 99,65 % (+ 0,65) (p = 0,87), e no leite foi de 90,87 % (+ 10,71) e 98,58 % (+ 2,19) (p = 0,0127) para as amostras sem e com suplementação, respectivamente.

Semelhante a estes achados, alguns autores têm apontado maior capacidade microbicida em animais com níveis adequados de selênio (WURYASTUTI et al., 1993; SALMAN et al., 2009). Além disso, uma correlação negativa entre a contagem de células somáticas e níveis séricos de selênio têm sido freqüentemente reportados (HEMINGWAY et al., 1999; SALMAN et al., 2009).

Ademais, inúmeros estudos sugerem que a deficiência de selênio pode levar a maior susceptibilidade a doenças ou a progressão da mesma. Assim, a manutenção de níveis adequados de Se é essencial para a regulação da resposta imune, além de proteger contra os danos oxidativos (McKENZIE et al., 1998; RAYMAN, 2000). É ainda sugerido, que a suplementação com Se pode apresentar efeito imunoestimulatório mesmo em pacientes com níveis adequados de selênio (RAYMAN, 2000), o que advir de seus efeitos diretos. Isto, por exemplo, já foi descrito em células T, onde o selênio apresentou função regulatória na expressão de receptores de interleucina-2 (IL-2) (McKENZIE et al., 1998). Desta maneira, isto também pode explicar os efeitos benéficos adquiridos com a suplementação de selênio dado pelo seu efeito regulatório na expressão dos receptores envolvidos com esta citocina, já que é conhecido que a infusão intramamária de IL-2 resulta em maior taxa de cura de animais infectados com Staphylococcus aureus (SALMAN et a.l, 2009).

CONCLUSÃO

O presente estudo apontou para aumento da capacidade microbicida in vitro de células polimorfonucleares suplementadas com Se em bovinos. Assim, a suplementação de Se pode apresentar como ferramenta viável no controle da mastite e demais enfermidades.

REFERÊNCIAS

HEMINGWAY, R. G. The influence of dietary selenium and vitamin E intakes on milk somatic cell counts and mastitis in cows. Veterinary Research Communications, Amsterdam, v. 23, p. 481-499, 1999.

HOGAN, J. S.; WEISS, W. P.; SMITH, K. L. Role of vitamin E and selenium in host defense against mastitis. Journal of Dairy Science, Champaign, v. 76, p. 2795-2803, 1993.

McKENZIE, R. C.; RAFFERTY, T. S.; BECKETT, G. J. Selenium: an essential element for immune function. Immunology Today, Cambridge, v. 19, n. 8, p. 342-345, 1998.

PAAPE, M. J.; BANNERMANN, D. D.; ZHAO, X.; LEE, J-W. The bovine neutrophil: structure and function. Veterinary Research, Les Ulis, v. 34, p. 597-627, 2003.

RAYMAN, M. P. The importance of selenium to human heath. Lancet, London, v. 356, p. 233-241, 2000.

SALMAN, S.; KHOL-PARISINI, SCHAFFT, H.; LAHRSSEN-WIEDERHOLT, M.; HULAN, H.W.; DINSE, D.; ZENTEK, J. The role of dietary selenium in bovine mammary gland heath and immune function. Animal Health Research Reviews, Wallingford, v. 10, n. 1, p. 21-34, 2009.

WURYASTUTI, H.; STOWE, H. D.; BULL, R. W.; MILLER, E. R. Effects of vitamin E and selenium on immune responses of peripheral blood, colostrum, and milk leukocytes of sows. Journal of Animal Science, Champaign, v. 71, p. 2464-2472, 1993.