PCR
MULTIPLEX PARA DETERMINAÇÃO DE
MARCADORES DE VIRULÊNCIA EM Escherichia
coli ISOLADAS DE BOVINOS COM DIARRÉIA EM MINAS GERAIS
Giovanna Ivo Andrade1,
Ethiene Luiza de Souza Santos2, Fernanda Morcatti Coura2,
Alice Alexandrina Souza Cunha2, Abel Fidelis Barbosa2 Mariana Moraes Falcão2, Juliana
Pinto da Silva Mol3, Marina Guimarães Ferreira4, Moises Dias
Freitas4, Elias Facury Filho5, Antônio Último de Carvalho5,
Paulo Marcos Ferreira5, Marcos Bryan Heinemann5, Andrey
Pereira Lage6
1.
Bióloga, MSc, Doutora, Bolsista PróDoc
CAPES / UFMG, Escola de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG
2.
Bolsista de Iniciação Cientifica, Escola
de Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG
3.
Bióloga, MSc, Doutoranda, Escola de
Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais – UFMG
4.
Médico Veterinário, MSc, Doutorando,
Escola de Veterinária, UFMG
5.
Médico Veterinário, MSc, Doutor, Professor,
Escola de Veterinária, UFMG
6.
Médico Veterinário, MSc, DSc, Professor,
Laboratório de Bacteriologia Aplicada, Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva, Escola de Veterinária da UFMG, Av. Antônio Carlos, 6627,
Caixa Postal 567, Campus da UFMG,
CEP 30123-970, Belo Horizonte, MG, Brasil.
E-mail: alage@vet.ufmg.br
(autor correspondente)
PALAVRAS-CHAVE:
EPEC,
epidemiologia, ETEC, fatores de virulência, STEC
ABSTRACT
PCR MULTIPLEX FOR THE DETERMINATION OF VIRULENCE
FACTORS IN ESCHERICHIA COLI ISOLATES FROM CALVES WITH DIARRHEA
Diarrhea is
one of the most common diseases in calves and leads to substantial economic
loss due to treatment costs, increased mortality and morbidity rates, and
growth constraints. Enterotoxigenic Escherichia
coli (ETEC), attaching and effacing E.
coli (AEEC) and Shiga toxin-producing E.
coli (STEC) have been identified as causes of diarrhea and dysentery in
calves. This study investigates virulence factors of E. coli strains isolated from calves by multiplex PCR. The animals
were up to 60 days old and were raised in
KEYWORDS: EPEC,
epidemiology, ETEC, STEC, virulence factors.
INTRODUÇÃO
A diarréia neonatal é a
síndrome mais importantes na criação de bezerras, pois causa altas perdas
econômicas decorrentes dos custos com tratamento de animais, aumento dos
índices de mortalidade e morbidade e redução nas taxas de crescimento (OK et
al., 2009). A síndrome diarréica tem etiologia e patogênese complexa, com
vários agentes infecciosos envolvidos, sendo a Escherichia coli um dos agentes mais importantes tanto em casos de
diarréia como em infecções extra-intestinais (BEUTIN et al., 2004). Amostras de
E. coli isoladas de ruminantes
domésticos, principalmente bovinos, foram relatadas como causa de
gastroenterite em humanos, que poderia progredir para Colite Hemorrágica e
Sindrome Urêmica Hemolítica (GÜLER et al., 2008).
E.
coli
patogênicas identificadas como causadoras de diarréia em bezerros são
classificadas, segundo os sinais clínicos e suas características de virulência
em: enterotoxigênicas (ETEC), “attaching and effacing” (AEEC),
enteropatogênicas (EPEC) e produtoras de toxinas do tipo Shiga (STEC), sendo que
se as amostras STEC apresentarem atividade “attaching and effacing” são ditas
enterohemorrágicas (EHEC). Fímbrias K99 e/ou F41 e a enterotoxina Sta são os
fatores de virulência de ETEC comumente isoladas de bezerros, que participam da
aderência ao íleo e causam hipersecreção no lúmen do intestino,
respectivamente. A proteína intimina participa da atividade de adesão ao
enterócito e destruição das microvilosidades intestinais
O diagnóstico da
infecção por E. coli baseia-se na
diferenciação fenotípica entre amostras patogênicas e não patogênicas. Testes
de aglutinação e ELISA são usados para a detecção de fímbrias e ensaios
biológicos complexos são comumente usados para a detecção de enteretoxinas.
Esses testes são, no entanto, laboriosos e complexos para uso
MATERIAL
E MÉTODOS
Coleta e preparo das amostras
As coletas foram feitas
em 20 propriedades leiteiras semi-intensivas nas regiões Centro-Oeste e do Alto
Paranaíba
Cerca de 1g de fezes
foi diluído em PBS (NaCl 0,015M, PO4 0,01M, pH 7,2) e adicionado em
meio não seletivo de pré-enriquecimento (água peptonada), com tempo de
incubação de 24 h à 37ºC. A identificação das enterobactérias foi realizada por
provas bioquímicas de rotina (FONTES, 1979). Amostras identificadas como E. coli nos testes bioquímicos foram
semeadas em placas contendo BHI sangue por 14 – 16h a 37oC. Após,
foram preparadas suspensões aquosas de cada amostra em microtubos de 1,5 mL, de
modo a obter 9,0 x 108 células/mL. Em seguida, foi feita extração
térmica do DNA por 10 minutos a 100oC e breve centrifugação (2 min.)
a 10.500 x g. O sobrenadante foi usado para a tipagem molecular do fatores de
virulência das amostras de E. coli
pela PCR multiplex (FRANCK et al.,
1998).
PCR Multiplex
O método foi baseado em
FRANCK et al. (1998), com modificações. A reação de PCR foi realizada a partir
de 5 μL de cada DNA extraído
e 15μL da solução mix,
contendo 0,2mM de cada
iniciador (Stx1 F/R, Int F/R, F41 F/R, K99 F/R, Sta F/R, Stx2 F/R) (IDT - Integrated DNA Technologies, ,USA),
RESULTADOS
E DISCUSSÃO
Das 133 amostras de
fezes submetidas ao isolamento e identificação de enterobactérias, 120 foram positivas
para Escherichia coli (90,22%).
Dessas 120 amostras, foram selecionados 156 isolados (48,9%) de E. coli pelos testes bioquímicos. Os
resultados da PCR multiplex mostraram
que destes 156 isolados, 105 (67,3%) foram negativos para fatores de virulência
e 51 (32,7%) apresentaram resultado positivo para vários genes marcadores de
virulência.
A diarréia por E. coli tem sido apontada como a
enfermidade mais importante de bovinos jovens, com variação nos índices de
morbidade e mortalidade dependentes do sistema de criação, agente envolvido e
capacidade de resposta do organismo. O manejo é o fator que mais influencia as
taxas de mortalidade dos bezerros jovens. Fatores como má higiene, colostragem
mal feita, parto não monitorado e tempo prolongado de permanência com a mãe
podem ser decisivos no aparecimento de diversas doenças em bezerros, dentre
elas as diarréias (RADOSTITS et al., 2007). A maioria das propriedades (95%)
incluídas neste estudo não utilizava vacinação contra agentes específicos de
enterites e apresentava condições inadequadas de manejo, resultando em índices
elevados de detecção de fatores de virulência presentes em E. coli enteropatogênicas
Diarréia em bezerros é
comumente causada por ETEC (HOLLAND, 1990). Neste estudo, E. coli enterotoxigênicas (ETEC) foram detectadas em 24 (~ 47%) de
51 amostras positivas na PCR multiplex,
congruente com dados da literatura (GÜLER et al., 2008). De 51 isolados, 22 (~
43%) representaram o total de STEC detectadas, com 15 (29,4%) positivos para
Stx1 e 6 (11,8%) positivos para ambos, Stx1 e Int. Resultado semelhante foi
encontrado por SALVADORI et al. (2003), pontuando a importância do gado como
reservatório de STEC no Brasil, o que representa um risco potencial à saúde
humana (SALVADORI et al., 2003; AIDAR-UGRINOVICH et al., 2007). Foram
encontradas cinco amostras (9,8%) positivas para o gene marcador de virulência
(eae) para a proteína de adesão
íntima, intimina. GÜLER et al. (2008) também detectaram poucas amostras
positivas para o gene eae em bezerros
na Turquia. Segundo HOLLAND (1990), a prevalência de infecções verdadeiras por
EPEC parece ser baixa em bovinos.
A PCR em formato multiplex usada neste estudo permitiu a
detecção simultânea de genes de virulência de E. coli, provando ser um método de diagnóstico rápido e eficiente.
O uso deste método para o diagnóstico e tipagem de enteropatógenos em amostras
fecais de bovinos tem aumentado nos últimos anos e serve para a detecção de uma
variedade de fatores de virulência de E.
coli em vários tipos de amostras e diferentes hospedeiros.
CONCLUSÕES
Os resultados obtidos
mostram que E. coli é um importante
patógeno causador de diarréia em bezerros em Minas Gerais e que a PCR multiplex
empregada nesse estudo é uma ferramenta útil para identificação e
caracterização de isolados de E. coli
de bovinos com diarréia.
AGRADECIMENTOS
A Fapemig, CNPq e FEP-MVZ
Coordenação Preventiva pelo auxílio financeiro. GIA é bolsista da Capes, ELSS,
FMC, AASC, e AFB da Fapemig e MGF, MDF e APL do CNPq.
REFERÊNCIAS
AIDAR-UGRINOVICH,
L.; BLANCO, J.; BLANCO, M. et al. Serotypes, virulence genes, and intimin types of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) and
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BEUTIN, L.; KRAUSE, G.; ZIMMERMANN, S. et al. Characterization
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of Clinical Microbiology, Washington, v. 42, p. 1099-1108,
2004.
FONTES,
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cultura e de um sistema simplificado para identificação de Enterobactérias.
78p. 1979. Tese (Mestrado em Microbiologia e Imunologia) - Escola Paulista de
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FRANCK, S. M.; BOSWORTH, B. T.; MOON, H. W. Multiplex
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GÜLER, L.; GÜNDÜZ, K.; OK, Ü. Virulence factors and
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SALVADORI,
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