INFLUÊNCIA DO PERÍODO PÓS-PARTO NO PROTEINOGRAMA DE VACAS
HOLANDESAS, OBTIDO ATRAVÉS DA TÉCNICA DE ELETROFORESE
João Paulo Elsen Saut1, Samantha
Ive Miyashiro2, Raquel Fraga e Silva Raimondo2, Eduardo Harry Birgel Junior3
1. Professor Adjunto da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia.
FAMEV-UFU – E-mail: jpsaut@usp.br (autor correspondente)
2. Doutorandos da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo – FMVZ-USP
3. Professor Livre-docente da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo – FMVZ-USP
PALAVRAS-CHAVE: Bovinos, proteína,
proteína de fase aguda, puerpério, SDS-PAGE.
ABSTRACT
INFLUENCE OF THE
PUERPERIUM PERIOD ON PROTEINOGRAM DETERMINED BY SODIUM DODECYL SULPHATE-POLYACRYLAMIDE GEL ELECTROPHORESIS
This study evaluates the influence of the
puerperium period on the proteinogram of Holstein cows. A total of 162 blood
samples were collected during the first 90 days after
parturition and divided into 9 experimental groups according to the time of
postpartum sample collection: 0 –| 1st day; 1st –| 2nd
day; 2nd –| 4th day; 4th –| 6th
day; 6th –| 8th day; 8th –| 15th
day; 15th –| 30th day; 30th –| 60th
day; and 60th –| 90th day. Total protein concentrations
were determined by the biuret method and proteins were separated by SDS-PAGE.
This procedure detected 21 protein bands and
molecular weights varied between 20kDa and 200kDa. The following protein
fractions were identified: ceruloplasmin (120kDa), hemopexin (87kDa),
transferrin (78kDa), albumin (62kDa), IgG heavy chain (53kDa), haptoglobin
(44kDa), acid glycoprotein (36kDa), and IgG light chain (28kDa). Protein levels
gradually increased during the puerperium period most likely due to transfer of
immunoglobulins into mammary glands. The acute phase protein
haptoglobin, acid glycoprotein, and ceruloplasmin increased in partum stimuli
and postpartum bacterial contamination. Transferrin protein decreased during
parturition showing a bacteriostatic effect against bacterial strains.
KEYWORDS: Acute phase protein,
cattle, protein, puerperium, SDS-PAGE.
INTRODUÇÃO
Considera-se como parto eutócico, fisiológico ou
normal o momento final da gestação fisiológica, quando, pelo nascimento do
produto, há separação orgânica maternal e do feto gerado. Nestas condições, há
dilatação da via fetal e o nascimento transcorre sem transtornos e riscos de
vida ou ferimentos para mãe e o bezerro (GRUNERT & BIRGEL, 1982).
O período imediatamente após o parto é de suma importância
na vida reprodutiva da vaca. Uma involução uterina normal e o restabelecimento
da função ovariana no pós-parto são cruciais para que se obtenha curto
intervalo entre parto e nova concepção, condição necessária para otimização da
produção de leite e bezerros (DOHMEN et al., 2000). Após a parição e
subseqüente gestação, quatro eventos devem ocorrer concomitantemente: a)
involução uterina, b) regeneração do endométrio, c) retorno à ciclicidade
ovariana e, d) eliminação da contaminação bacteriana (SHELDON, 2004).
O
fracionamento eletroforético das proteínas sangüíneas representa um dos mais
confiáveis métodos para a sua identificação (FAGLIARI & SILVA, 2002). A
técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de
sódio (SDS-PAGE) possibilita a visualização de concentrações protéicas
extremamente baixas, identificação de
As proteínas de fase aguda são encontradas no soro em
altas concentrações durante a instalação do processo inflamatório (ALSEMGEEST
et al., 1994), podendo ser avaliadas em situações clínicas, pois se acredita
que sejam melhores indicadores da resposta sistêmica ao processo inflamatório
ou infeccioso do que outras variáveis, tais como febre, aumento no tempo de
sedimentação de eritrócitos e leucocitose associada à neutrofilia (HORADAGODA et al., 1999).
Este trabalho teve como objetivo
avaliar a influência do período pós-parto no proteinograma de bovinos da raça
Holandesa, através do fracionamento das proteínas séricas por
eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio
(SDS-PAGE).
MATERIAL
E MÉTODOS
Foram
colhidas 162 amostras de sangue de fêmeas bovinas clinicamente
sadias e divididas em 9 grupos experimentais, 0 –| 1º dia;
1º –| 2º dia; 2º –|
4º dia; 4º –| 6º dia; 6º –| 8º
dia; 8º –| 15º dia; 15º –| 30º dia;
30º –| 60º
dia; e, 60º –| 90º dia pós-parto. As
amostras de sangue foram colhidas por punção da veia jugular externa,
utilizando-se sistema Vacutainer®. Após, as amostras foram centrifugadas por 15
minutos e o soro separado, por aspiração, utilizando-se pipetas Pasteur, em
alíquotas, acondicionadas em tubos plásticos e conservadas em freezer a menos
20°C.
A determinação dos
teores séricos de proteína total foi feita pelo método do biureto. Para o
fracionamento das proteínas foi realizada a eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), conforme a técnica
descrita por LAEMMLI (1970) e as recomendações de FAGLIARI & SILVA (2002).
A quantificação da frações foi realizada em densitômetro (Byosistems, modelo
Epson Expression 1680), com uso de “software” de análise de imagens
VisionWorksLS (Ultra-Violet Products). Para perfeita identificação das frações
protéicas do soro sangüíneo foi utilizado, em cada corrida de eletroforese, um
marcador padrão de pesos moleculares da marca Invitrogen com bandas entre 10
kDa e 220 kDa. Para a análise
estatística, utilizou-se o programa Minitab - versão 14.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os valores séricos da
concentração das proteínas totais obtidos em amostras colhidas com menos de 24
horas após o parto (7,33 ± 0,82 g/dL) aumentaram gradativamente nos primeiros
dias do puerpério, atingindo valor significativamente diferente nas amostras
colhidas entre 15 –I 30 dias após o parto (8,08 ± 0,51 g/dL), concordando com
FEITOSA & BIRGEL (2000) e FAGLIARI et al. (1998). Os baixos valores de
proteínas total nos primeiros dias após a parição, nesta pesquisa, devem-se,
seguramente, à transferência de globulinas para a glândula mamária para a
formação de colostro (NATH et al., 2005).
A eletroforese em gel de
poliacrilamida (SDS-PAGE) permitiu identificar 21 bandas protéicas, cujos pesos
moleculares variaram de 20 KDa a 200 KDa. A partir do método utilizado foi
possível a identificação nominal de 8 destas proteínas: ceruloplasmina (120
kDa), hemopexina (87 kDa), transferrina (78 kDa), albumina (62 kDa), cadeia
pesada de imunoglobulinas (53 kDa), haptoglobina (44 kDa), glicoproteína ácida
(36 kDa) e cadeia leve de imunoglobulinas (28 kDa). As demais 13 bandas
protéicas foram identificadas apenas com base nos respectivos pesos
moleculares, como segue: 187 kDa, 163 kDa, 144 kDa, 133 kDa, 107 kDa, 95 kDa,
40 kDa, 38 kDa, 34 kDa, 33 kDa, 31 kDa, 25 kDa e 23 kDa.
A eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) a 10%, utilizando
tampão de aplicação com agente redutor, não se mostrou uma boa técnica para a
determinação da concentração de albumina e imunoglobulinas.
A transferrina, proteína
de fase aguda negativa, apresentou queda na concentração sérica após o parto
(132,8 ± 67,4 mg/dL) chegando ao patamar mínimo entre o 6 º –I 8 º dia (38,03 ±
19,47 mg/dL), retornando somente no 8º –I 15º dia pós-parto (108,1± 62
mg/dL). Uma das funções da transferrina
é a habilidade de seqüestrar o ferro livre circulante removendo um dos
nutrientes essenciais para o crescimento bacteriano, desta forma agindo como
elemento bacteriostático. Esta função assume papel fundamental na parição, pois
no momento do parto o útero é exposto a uma série de microorganismos (SHELDON,
2004).
Foi possível identificar
três proteínas de fase aguda positivas: ceruloplasmina, haptoglobina e
glicoproteína ácida. Estas proteínas elevam suas concentrações plasmáticas
imediatamente após a instalação de um processo inflamatório (GODSON et al.,
1996).
A parição provocou uma
resposta de fase aguda demonstrado pelo aumento das proteínas de fase aguda
positiva: ceruloplasmina e haptoglobina. Estas proteínas provavelmente
responderam aos danos teciduais decorrentes da passagem do feto pelo canal
cervical e a expulsão dos anexos fetais, além de possível influência do
cortisol e da prostaglandina aumentados nesta fase (ALSEMGEEST et al., 1993).
Após o parto, foi demonstrado um segundo aumento destas proteínas que
correspondeu ao estímulo da contaminação bacteriana instalada no útero após o
parto (ALSEMGEEST et al., 1993;
REGASSA; NOAKES, 1999). A glicoproteína ácida apresentou menor aumento.
As proteínas
ceruloplasmina e haptoglobina apresentaram uma terceira elevação, que pode
estar relacionado a possíveis estímulos infecciosos, devido às variações nas
populações bacterianas e grau de infecção (SHELDON et al.,2001). O grau de
inflamação e as camadas envolvidas do útero poderia ser um fator que
influenciasse na concentração das proteínas de fase aguda (SMITH et al., 1998).
CONCLUSÕES
Ocorreu aumento significativo e transitório das
proteínas de fase aguda, as quais responderam ao estímulo do parto e à
contaminação bacteriana pós-parto, demonstrando desta forma a habilidade dos
mecanismos de defesa uterina de eliminar processos infecciosos nesta fase de
vacas com pós-parto fisiológico. A técnica de eletroforese em gel de
poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio
(SDS-PAGE) a 10%, com
tampão de aplicação com agente redutor, não é indicada para o estudo do
comportamento das proteínas albumina e imunoglobulinas.
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