e
por eletroforese capilar em equipamento automático de análise de
fragmentos de DNA (ABI-310 Applied Biosystem) (DIAS e al., 2006).DOI: 10.5216/cab.v14i3.7638
PCR
FLUORESCENTE ASSOCIADA À ELETROFORESE CAPILAR COMO FERRAMENTA
DE DIAGNÓSTICO DE BACTÉRIAS NO SEMEN
Francisca Elda Ferreira Dias1, Cáris Marone
Nunes2, Tânia Vasconcelos Cavalcante1, Andréa
Azevedo Pires de Castro3, Jorge Luis Ferreira1,
José Fernando Garcia2
1Professores
Doutores da Universidade Federal do Tocantins, Araguaína, TO, Brasil.
eldadias@uft.edu.br
2Professores
Doutores da Universidade Estadual Paulista, Campus Araçatuba, Araçatuba,
SP, Brasil.
3Pós-Graduanda
da Universidade Federal do Tocantins, Araguaína, TO, Brasil.
RESUMO
Este
estudo
avaliou o limiar de detecção da técnica de PCR aliada à eletroforese
capilar para diagnóstico da Brucella
abortus
em sêmen bovino. Doses inseminantes livres de patógenos foram
contaminadas experimentalmente com B.
abortus em escalas que variavam de 100 a 107
bactérias/mL e submetidas à extração de DNA pelo método de
fenol/clorofórmio. A amplificação por PCR foi realizada utilizando-se
oligonucleotídeos iniciadores, previamente descritos na literatura,
BF–5’gcgctcaggctgccgacgcaa3’ (cromóforo FAM) e
BR–5’accagccattgcggtcggta3’ para B.
abortus.) Os pares de oligonucleotídeos geraram fragmentos de 193
pb. Após PCR, a visualização dos fragmentos foi realizada em gel de
acrilamida 8% corada pela prata e por eletroforese capilar fluorescente
em equipamento automático de análise de fragmentos de DNA. A detecção de
DNA de B. abortus em sêmen bovino através de eletroforese capilar
fluorescente foi possível a partir de concentração de 103
bactérias/mL, enquanto que em gel de poliacrilamida 8% o limite de
detecção foi de 105 bactérias/mL. A
eletroforese capilar demonstrou ser uma alternativa rápida, eficaz e
de alta sensibilidade na detecção de DNA de Brucella
em sêmen bovino, podendo ser uma valiosa ferramenta para a avaliação da
sanidade do rebanho e para o controle de qualidade do sêmen produzido em
centrais de inseminação artificial.
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FLUORESCENT PCR ASSOCIATED WITH
CAPILLARY ELECTROPHORESIS AS A DIAGNOSTIC TOOL OF BACTERIA IN SEMEN
ABSTRACT
ABSTRACT
This study was
performed in order to evaluate the detection limit of PCR with
fluorescent capillary electrophoresis for Brucella
abortus diagnosis in bovine semen. Negative bovine semen samples
were artificially contaminated with B.
abortus (100 to 107 bacteria/mL) and DNA was
extracted by phenol/chloroform protocol. DNA was amplified by PCR with
oligonucleotides previously described BF–5’gcgctcaggctgccgacgcaa3’
(6-FAM labeled) and BR–5´accagccattgcggtcggta3’ for B.
abortus. Oligonucleotides generated DNA fragments of 193 bp. DNA
fragments visualization was done under UV light at silver stained 8%
poliacrylamide gel, and fluorescent capillary electrophoresis performed
in an automatic DNA fragment analyzer. The detection limit of capillary
electrophoresis for B. abortus
was 103 bacteria/mL, while for silver stained 8%
poliacrylamide gel it was 105 bacteria/mL. PCR with
fluorescent capillary electrophoresis is fast, efficient and highly
sensitive test for DNA detection of Brucella
in bovine semen, and itcan be an important tool for health evaluation of
the herd and semen sanitary control in artificial insemination centers.
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INTRODUÇÃO
A Brucelose é causada por
bactérias gram-negativas intracelulares facultativas do gênero Brucella
e continua a ser um problema para humanos e animais em todo o mundo
(POESTER et al., 2002; BRICKER, 2002). É uma importante antropozoonose de
grande importância tanto para a saúde publica quanto para a economia das
regiões onde ocorre, devido à alta taxa de abortamento e infertilidade em
rebanhos infectados (LEAL-KLEVEZAS et al., 1995; BRICKER, 2002).
Mesmo nos países onde todas as
formas da doença foram erradicadas, continua essencial a prevenção da
possível reintrodução da doença. Um ponto crítico para o sucesso dos
trabalhos de prevenção é a disponibilidade de uma boa ferramenta de
diagnóstico (BRICKER, 2002). O diagnóstico da doença é feito,
principalmente, por meio dos procedimentos clássicos, que se baseiam no
crescimento do agente infeccioso em cultura, o que pode levar semanas, ou
na detecção de sua presença por métodos imunológicos, que apresentam
variável sensibilidade e especificidade (LEAL-KLEVEZAS et al., 1995;
MANTEROLA et al., 2003).
Nos últimos anos, técnicas
moleculares de diagnóstico embasadas na metodologia de PCR constituem
substancial avanço na detecção rápida de bactérias em diferentes tipos de
amostras, como Mycobacterium
tuberculosis no leite (FIGUEIREDO et al., 2008), Mycoplasma
spp na rotina de cultivo celulares (CAMARGOS et al., 2008) e Escherichia
coli em amostras de
água, fezes e leite (VICENTE et al., 2008).
Recentemente, a técnica de
reação em cadeia pela polimerase (PCR) começou a ser avaliada para a
detecção de agentes infecciosos no sêmen de bovinos, tornando-se uma
alternativa eficiente e promovendo o diagnóstico rápido e específico
(MASRI et al., 1997; HEINEMANN et al., 1999; SMITS et al., 2000; MOORE et
al., 2000; MANTEROLA et al., 2003; SANTOS, 2007). Trabalhos recentes
realizados por HEINEMANN et al.
(2000) e DIAS et al. (2006) demonstraram a viabilidade do diagnóstico de Leptospira por PCR no sêmen bovino.
O presente estudo teve como
objetivo avaliar o uso da técnica de PCR aliada à eletroforese capilar
para a detecção de Brucella abortus em sêmen bovino contaminado experimentalmente.
MATERIAL E MÉTODOS
O presente experimento foi
desenvolvido no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular Animal,
localizado na Faculdade de Odontologia de Araçatuba, curso de Medicina
Veterinária da UNESP, Araçatuba, São Paulo, Brasil.
As cepas de Brucella
abortus utilizadas neste estudo foram gentilmente cedidas pelo
Laboratório IRFA – Química e Biotecnologia Industrial Ltda, Porto Alegre,
RS, Brasil. As bactérias foram inativadas pelo calor a 100°C por 15
minutos e sua concentração (2,8 x 108 bactérias/mL)
foi determinada no laboratório de origem por contagem de células
bacterianas em campo escuro.
Amostras de sêmen bovino,
empregadas para a contaminação experimental com Brucella, foram obtidas
de um touro da raça Nelore da Central de Inseminação Artificial Lagoa da
Serra, localizada no município de Sertãozinho, Estado de São Paulo. O
critério adotado para a utilização do sêmen foi o de não apresentar
resultado positivo para o agente em questão, determinado por sorologia ou
cultivo. Realizou-se a contagem de espermatozoides do ejaculado em câmara
de Neubauer e realizou-se a diluição da dose inseminante em solução
estéril salina (0,9%) para o volume de 500µL
contendo 3x107 espermatozóides/mL.
A contaminação experimental do
sêmen foi realizada com concentrações decrescentes de Brucella abortus obtidas por meio de diluições seriadas na base 10
(107 a 100 bactérias/mL), para assim determinar a
menor concentração de DNA bacteriano capaz de ser detectada através da
técnica de PCR.
A extração do DNA das
bactérias usadas para a contaminação experimental do sêmen foi realizada
em microtubos de polipropileno de 1,5 mL, segundo o protocolo descrito por
HEINEMANN et al. (2000). Foram utilizados os oligonucleotídeos iniciadores
para amplificar 193 bp de Brucella
abortus bf-5’GCGCTCAGGCTGCCGACGCAA3’ (marcado com substância
fluorescente FAM - Invitrogen-Life Technologies®)
e br-5’ACCAGCCATTGCGGTCGGTA3’ previamente descritos (LEAL-KLEVEZAS, et
al., 1995).
As reações de PCR para
detecção de Brucella abortus
foram realizadas em microtubos de 200µL,
em
volume total de 50 µL
contendo os seguintes reagentes: 5µL
de tampão de reação 10x (concentração final 200 mM Tris-HCl, pH 8,4); 4 µL de
cloreto de magnésio (concentração variável) (Invitrogen-Life Technologies®);
2 µL
de Desoxiribonucleotídeo Trifosfatado (dNTPs) 1,25 mM de cada [dCTP,
dATP, dGTP, dTTP]; 3 µL
de cada oligonucleotídeo iniciador (10 pmol por µL);
1
µL
de Taq DNA polimerase (Invitrogen-Life Technologies®);
5µl
de amostra de DNA e água ultrapura q.s. (Invitrogen-Life Technologies®) para completar o volume total. Além
disso, foram utilizados controles negativos contendo todos os reagentes
exceto DNA para monitoramento de possíveis contaminações. As amostras
foram submetidas a uma denaturação inicial por 5 minutos a 95º C, 35
ciclos de 95º C por 60 segundos, 60º C por 60 segundos
e 72º C por 60º C e extensão final a 72º C por 5 minutos. As
condições de amplificação foram realizadas em termociclador (PTC-100 MJ-Research®). Para
verificar a amplificação espécie-especifica dos oligonucleotídeos
utilizados, foi realizada uma PCR com DNA de amostras de sêmen contaminadas experimentalmente
com Brucella abortus, Leptospira
interrogans sorotipo pomona, Campilobacter fetus e Haemophilus
somnus.
A análise dos fragmentos de
DNA bacteriano foi realizada por eletroforese convencional em gel de
acrilamida-bis-acrilamida 8% (Invitrogen), corado com prata
e
por eletroforese capilar em equipamento automático de análise de
fragmentos de DNA (ABI-310 Applied Biosystem) (DIAS e al., 2006).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em nosso estudo foram
utilizadas informações referentes ao gene outer
membrane
protein (omp-2) de Brucella
abortus extraídas de artigo
clássico de LEAL-KLEVEZAS et al. (1995), que conseguiram amplificar Brucella spp. a partir de diversos materiais biológicos.
Os resultados da amplificação
de DNA de amostras de sêmen contaminado experimentalmente com Brucella
abortus, pela técnica de PCR, mostraram que os oligonucleotídeos
iniciadores empregados resultaram em amplificações específicas para o DNA
de Brucella (Figura 2)
com a amplificação de um fragmento de 193 pares de bases.
Para excluir a possibilidade
de que os oligonucleotídeos tivessem reação cruzada com o DNA de outras
bactérias possíveis de serem encontradas nesse tipo de material biológico,
a Figura
1 mostra a especificidade dos oligonucleotídeos utilizados
neste estudo.
As Figuras 2 e 3 apresentam
os produtos de amplificação por PCR a partir do DNA de Brucella abortus, em amostras de sêmen bovino contaminadas
experimentalmente, nas quais se observam os resultados da amplificação em análise em gel de
piliacrilamida 8% e por eletroforese capilar, respectivamente.
As detecções do DNA de
bactérias patogênicas após reação de PCR são normalmente realizadas por
gel de eletroforese; entretanto, o gel de eletroforese é regularmente
pouco sensível e requer longo tempo para separação, o que impõe limitações
à total eficiência das técnicas de PCR para análise rápida e específica
(SONG et al.,
2003). Neste estudo, pôde-se perceber a maior rapidez para análise
dos fragmentos de DNA após sua extração quando esta análise é realizada em
equipamento automático ao se comparar com a eletroforese convencional, que
demanda maior tempo e apresenta resultados dúbios.
A Figura 2 mostra o limiar da
detecção de Brucella abortus
em sêmen bovino contaminado experimentalmente, analisado em eletroforese
convencional em gel de poliacrilamida corado com nitrato de prata,
indicando positividade até 105 bactérias/mL,
a partir da concentração inicial da solução estoque de Brucella
abortus. Quando analisada por
eletroforese capilar (Figura
3), a mesma amostra apresentou sinal positivo até diluição
de 103 bactérias/mL. Segundo SONG et al. (2003), rapidez e
sensibilidade são os mais importantes fatores a serem considerados na
detecção de bactérias, porque mesmo um único organismo patogênico pode
resultar numa dose infectante.
O uso de marcação fluorescente
utilizada neste estudo acoplada ao PCR com posterior detecção em sistema
automático de análise de fragmentos de DNA pode ser uma alternativa para o
incremento dessa aplicação (ENGLUND et al., 2001; CHECA et al., 2002; SONG
et al., 2003). Poucos são os estudos que reúnem a amplificação de
patógenos por PCR com sua detecção em sistema automático para análise de
fragmentos de DNA marcados com fluorocromos. ENGLUND et al. (2001)
compararam a detecção de Mycobacterirum
avium subespécie
paratuberculosis em amostras biológicas de aves utilizando PCR
simples, PCR fluorescente e nested-PCR, e afirmaram que o PCR fluorescente
constitui-se em alternativa útil ao PCR simples e nested-PCR para a
detecção do patógeno, devido à maior sensibilidade e capacidade conferida
pela automação.
A análise de fragmentos de PCR
fluorescente por eletroforese capilar no diagnóstico de doenças
infecciosas pode ser considerada ainda pouco estudada; entretanto, a
melhor capacidade de detecção por esse método observada ao longo dos
experimentos construídos no presente trabalho e em estudo realizado por
DIAS et al., (2006), que mostraram que a detecção é ampliada quando em
comparação à análise eletroforética convencional em gel de poliacrilamida
na detecção de Leptospira pomona em sêmen bovino. Outro ponto de relevância é a
maior facilidade de leitura dos resultados em eletroforese capilar quando
comparada à poliacrilamida. Esses achados ratificam as conclusões de
ENGLUND et al. (2001), que preconizaram a detecção de fragmentos de PCR
com marcação fluorescente não pelo fato de haver aumento na sensibilidade,
mas, principalmente, pela possibilidade de interpretar resultados ambíguos
de PCR na análise em eletroforese em gel de poliacrilamida e agarose,
métodos tradicionais de analise dos fragmentos de DNA.
Dentre os diversos patógenos
listados pela World Organisation for Animal Health (OIE) que afetam a
bovinocultura, (THIBIER & GUERIN, 2000), alguns têm papel relevante na
situação brasileira como, por exemplo, a Brucella
abortus (POSTER et al., 2002), a Leptospira
sp. (HEINEMANN et al., 2000) e o Campylobacter
fetus (VARGAS et al., 2003).
Atualmente, os métodos de
diagnóstico utilizados para identificar os animais portadores de agentes
infecciosos incluem: isolamento em meio de cultivo quimicamente definido
ou em cultivos celulares, inoculação em animais susceptíveis,
soroneutralização, teste de fixação de complemento, ELISA,
imunofluorescência indireta, hemaglutinação e imunodifusão (CICERONI et
al., 2002; MANTEROLA et al., 2003). Entretanto, a maioria dessas técnicas
apresenta limitações de ordem prática resultante de sua complexidade, da
lentidão dos procedimentos laboratoriais para detecção e caracterização do
agente infeccioso ou da infra-estrutura necessária para a sua realização.
Além disso, limitações relativas à sensibilidade e especificidade
tornam-se complicadores para a realização de diagnóstico prático, preciso
e de baixo custo (VELOSO et al., 2000; CICERONI et al., 2002; MANTEROLA et
al., 2003).
Segundo SANTURDE et al.
(1996), ROCHA et al. (1998), SMITS et al. (2000), ORTEGA-MORA et al.
(2003), MUKHUFHI et al. (2003) e SANTOS (2007), o avanço tecnológico nos
métodos de diagnóstico, em especial daqueles envolvendo rotinas de
biologia molecular, apresentam um grande potencial para integrarem testes
de seleção e controle de touros doadores de sêmen quanto à presença de
agentes infecciosos. No presente estudo, buscou-se o desenvolvimento de
metodologia para acessar a presença de Brucella,
bactéria de relevância sanitária e, consequentemente econômica, em
amostras de sêmen bovino aliando rapidez e eficiência.
Recentemente, técnicas de PCR
para a detecção de agentes infecciosos vêm sendo bastante utilizadas por
sua precisão e sensibilidade. Essas vantagens permitem identificação
extremamente específica, permitindo distinguir os diferentes sorotipos de
bactérias (HEINEMANN et al., 1999; 2000; VARGAS et al, 2003).
Analisando especificamente
amostras de sêmen, AMIN et al. (2001) relataram a aplicação da técnica de
PCR para a detecção de Brucella
militensis em sêmen caprino e
MANTEROLA et al. (2003) avaliaram a PCR para detecção de Brucella ovis em sêmen
ovino com sucesso. Entretanto, ainda são poucas as pesquisas para detecção
de agentes infecciosos de transmissão venérea em amostras de sêmen.
Tais resultados indicam que a
eletroforese capilar pode ser uma alternativa na detecção de DNA de Brucella
abortus no sêmen, sendo uma forma de diagnóstico rápida e eficaz de
detecção desse patógeno quando comparada ao sistema eletoforético
tradicional. Portanto,
podemos concluir que a eletroforese capilar aliada à PCR é uma valiosa
ferramenta na detecção de Brucella
abortus por permitir mais rapidez e sensibilidade, vantagens que
poderão, no futuro, ser adicionadas aos métodos convencionais de detecção
de bactérias no sêmen bovino, podendo vir a constituir um recurso a mais
no diagnóstico para assegurar a produção de sêmen livre de agentes
infecciosos em centrais de inseminação artificial.
AGRADECIMENTOS
À FAPESP (Nº01/05486-1). À
central de Inseminação Artificial Lagoa da Serra pelas amostras de sêmen
bovino. Ao Prof. Sérgio Oliveira do Laboratório IRFA – Química e
Biotecnologia Industrial Ltda pela Bactéria.
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Protocolado
em:
5 out. 2009. Aceito em: 07
maio 2013