EFEITO DO DIÂMETRO FOLICULAR SOBRE A QUALIDADE DOS OÓCITOS OBTIDOS DE OVÁRIOS DE OVELHAS (Ovis aries) E CABRAS (Capra hircus)
O presente estudo teve como objetivo
avaliar a influência do diâmetro folicular sobre a qualidade dos
oócitos obtidos de ovários de fêmeas ovinas e caprinas. Utilizaram-se
156 ovários de ovelhas e 105 de cabras, provenientes de abatedouro. Os
folículos foram mensurados, aspirados e divididos em três classes de
diâmetro folicular: classe 1 (CI) – 2 a 3 mm, classe 2 (CII) – 4 a 5 mm
e classe 3 (CIII) – 6 mm. Os oócitos recuperados foram avaliados e
classificados quanto ao aspecto morfológico em cinco grupos de
qualidade: grau 1 (GI), grau 2 (GII), grau 3 (GIII), desnudo (D) e
atrésicos (A). Dos 468 folículos aspirados de ovinos, foram encontrados
327 CI, 84 CII, 57 CIII e 83 GI, 78 GII, 95 GIII, 119 D, 93 A. E dos
422 folículos aspirados de caprinos, foram encontrados 197 CI, 132 CII,
92 CIII e 64 GI, 70 GII, 91 GIII, 123 D, 74 A. Os dados obtidos
demonstram não haver correlações significativas entre qualidade dos
oócitos e diâmetro dos folículos (P > 0,05). Nas condições em que se
desenvolveu este estudo, os resultados permitem concluir que o diâmetro
folicular não exerce influência sobre a qualidade do complexo
cumulus-oócito (COC) recuperado de ovários de fêmeas ovinas e caprinas.
PALAVRAS-CHAVES: Células cumulus, folículo aspirado, qualidade oocitária.
This study aimed to evaluate the
influence of follicular diameter on the quality of oocytes from ovaries
of female sheep and goats. The ovaries of sheep (156 units) and goats
(105 units) from slaughterhouse were used. The follicles were measured,
aspirated and divided into three classes of follicular diameter: class
1 (CI) – 2 to 3 mm, class 2 (CII) – 4 to 5 mm and class 3 (CIII) – 6
mm. The recovered oocytes were evaluated and classified according to
morphological aspect in 5 quality groups: grade 1 (GI), grade 2 (GII),
grade 3 (GIII), naked (N) and atresia (A). Of the 468 follicles
aspirated from sheep, 327 CI, 84 CII, CIII 57 and 83 GI, 78 GII, GIII
95, 119 N, 93 A were found, and from the 422 follicles aspirated from
goats 197 CI, 132 CII, 92 CIII and 64 GI, 70 GII, 91 GIII, 123 N,
74 A were found. The data did not show significant correlation between
quality of oocytes and diameter of follicles (P > 0.05). Under the
conditions observed in this study it was concluded that the follicular
diameter has no influence on the quality of cumulus-oocyte complex
(COC) recovered from the ovaries of female sheep and goats.
KEYWORDS: Aspirated follicle, cumulus cells, oocyte quality.
INTRODUÇÃO
Nos meados da década de 1980 foram obtidos os primeiros produtos oriundos da fecundação
in vitro (FIV) de oócitos ovinos (CHENG
et al., 1986) e de oócitos caprinos maturados
in vitro (HANADA, 1985). Alguns anos mais tarde, foi relatado o nascimento do primeiro cordeiro oriundo da realização de todas as etapas
in vitro, isto é, desde a maturação dos oócitos até o desenvolvimento de mórulas (CROZET
et al., 1987).
A biotécnica de produção
in vitro
de embriões (PIVE) de pequenos ruminantes obteve avanços e foi
rapidamente incorporada à reprodução destas espécies. No entanto, a
taxa de desenvolvimento embrionário ainda é, em média, 10% a 15% dos
oócitos ovinos (BERNARDI, 2005) e 5% a 10% dos oócitos caprinos
(GIBBONS
et al., 2008) maturados, que chegam até o estádio de blastocisto.
A colheita de oócitos por Ovum Pick-Up guiada por laparoscopia (LOPU) tem sido usada com sucesso na espécie ovina (BALDASSARRE
et al.,
1996) e na espécie caprina (TERVIT, 1996). A LOPU em ovelhas e cabras
não tratadas com hormônios propicia a recuperação de, aproximadamente,
quatro oócitos por fêmea ovina e seis oócitos por fêmeas caprinas
(RUBIANES & MENCHACA, 2003). No caso de fêmeas estimuladas com FSH
ou FSH/LH, o número de oócitos obtido por sessão de aspiração foi de
dez a onze para as duas espécies (PTAK
et al., 1999).
Os cientistas tentam entender o sistema reprodutivo de fêmeas
domésticas através da manipulação do desenvolvimento folicular,
procurando produzir maior número de oócitos competentes para a
fecundação (BLONDIN
et al.,
2002). Numerosas pesquisas têm estudado as diferentes características
foliculares, como competência para o crescimento, tamanho folicular,
folículos saudáveis, perfil hormonal e status ovariano (CASTILHO &
GARCIA, 2005).
Durante o período interovulatório em pequenos ruminantes, o crescimento
folicular ocorre em padrões de ondas, tanto na estação de acasalamentos
(EVANS
et al., 2000; VINOLES
et al., 2002) como na estação de anestro (BARTLESWKI
et al.,
1998) e no período de transição entre estas duas estações (RAVINDRA
& RAWLINGS, 1997). O número de ondas foliculares por ciclo varia
entre duas e quatro em ovinos (VINOLES
et al., 2002) e quatro e seis em caprinos (BALDASSARRE
et al.,
2002), com altas variações individuais, sendo mais frequentes três
ondas foliculares em ovelhas e cinco em cabras. Dessa forma, a maioria
das aspirações foliculares é realizada em estádio aleatório do ciclo
estral, em diferentes fases de crescimento folicular e sujeito a
diferentes concentrações hormonais, o que afeta a qualidade dos oócitos
obtidos (GIBBONS
et al., 2008).
A influência do tamanho folicular na qualidade e competência oocitária
para o desenvolvimento in vitro tem sido exaustivamente estudada em
bovinos, e esses estudos indicam que folículos maiores geram oócitos
com melhor competência (PAVLOK
et al., 1992; LONERGAN
et al., 1994; CAROLAN
et al., 1996; HENDRIKSEN
et al., 2000; SENEDA
et al.,
2001). No entanto, ainda não há um consenso entre os trabalhos em
bovinos e, principalmente, quando são estudadas ovelhas (TERVIT
et al., 1972) e cabras (IZQUIERDO
et al.,
1999). O presente estudo teve como objetivo avaliar a influência do
diâmetro folicular sobre a qualidade dos oócitos obtidos de ovários de
fêmeas ovinas e caprinas abatidas em matadouros.
MATERIAL E MÉTODOS
Os ovários utilizados foram obtidos de fêmeas ovinas e caprinas
abatidas no abatedouro Suimax, localizado na cidade de Igarassu, Região
Metropolitana da Cidade do Recife. Colocaram-se os ovários em
recipiente térmico contendo solução salina a 0,9% aquecida a 30ºC e
acrescida 30 µg/mL de sulfato de gentamicina. Imediatamente foram
transportados ao Laboratório de Biotécnica da Reprodução do
Departamento de Medicina Veterinária da Universidade Federal Rural de
Pernambuco, em tempo não superior a uma hora, após o abate.
No laboratório, os ovários foram lavados em solução salina, mantidos em
banho-maria a 37ºC e todos os folículos visíveis foram mensurados com
paquímetro e divididos em três classes de diâmetro folicular: classe I
(CI) – medindo de 2 até 3 mm; classe II (CII) – medindo 4 mm até 5 mm e
classe III (CIII) ≥ 6 mm. Após ser realizada essa classificação,
procedeu-se à aspiração dos oócitos com o auxílio de seringas de 5 mL e
agulhas 19G1/2.
Os oócitos recuperados foram colocados em placas de Petri com DMPBS
(Nutricell) e líquido folicular, para serem observados e selecionados
em lupa estereomicroscópica (Nikon, SMZ800), com objetiva de 4x. Nesta
seleção, observou-se o aspecto morfológico do complexo cumulus-oócito
(COC), segundo LONERGAN
et al.
(1994), em cinco grupos de qualidade. O grau I (GI) apresenta cumulus
compacto, contendo mais de três camadas de células; o grau II (GII),
cumulus compacto parcialmente presente em volta do oócito ou rodeando
completamente o oócito, com menos de três camadas celulares; o grau III
(GIII), cumulus presente, com apenas uma camada de célula; desnudo (D),
ausência de camada de célula do cumulus, e atrésicos (A), células do
cumulus em regressão.
Para fins de comparação, os oócitos foram classificados em escores
segundo sua qualidade em oócitos atrésicos escore 0, oócitos desnudos
escore 1, oócitos grau I escore 2, oócitos grau II escore 3 e oócitos
grau III escore 4. Para correlacionar os escores de qualidade oocitária
com o tamanho folicular, empregou-se o teste não paramétrico de
Spearman.
RESULTADOS
Foram aspirados 468 folículos ovinos, sendo 327 classificados como
classe I, 83 classe II e 57 classe III. Quanto ao aspecto morfológico
dos COCs, foram 83 grau I, 78 grau II, 95 grau III, 119 desnudos e 93
atrésicos. Não se observou correlação significativa (P > 0,05) entre
qualidade dos oócitos e tamanho dos folículos (r = 0,02018). Os
resultados obtidos para os diferentes tamanhos dos oócitos ovinos
avaliados e as respectivas classificações sobre a qualidade estão
apresentados na
Tabela 1.
Os resultados obtidos para os diferentes tamanhos de folículos
avaliados e as respectivas classificações sobre a qualidade dos 422
folículos de fêmeas caprinas aspirados estão apresentados na
Tabela 2.
Desses, 197 foram classificados como Classe I, 132 Classe II e 92
Classe III. Quanto ao aspecto morfológico dos COCs observados, 64 grau
I, 70 grau II, 91 grau III, 123 desnudos e 74 atrésicos. Não foi
observada correlação significativa (P > 0,05) entre qualidade dos
oócitos e tamanho dos folículos (r = 0,02421).
DISCUSSÃO
A ausência de correlação entre o diâmetro folicular e a qualidade dos
oócitos pode ser atribuída à dinâmica folicular característica dos
pequenos ruminantes como citado por VINOLES
et al.
(2002). Dessa forma, em qualquer fase do ciclo estral existem folículos
em crescimento, ou sofrendo atresia. A atresia dos folículos recrutados
ocorre em função da diminuição da concentração plasmática de FSH (ADAMS
et al.,1992), induzindo no folículo queda no estradiol intrafolicular (KRUIP & DIELEMAN, 1985; KRUIP
et al., 1994). Todas essas alterações hormonais induzem alterações na qualidade do oócito.
Segundo VASSENA
et al. (2003),
a qualidade do oócito é de suma importância nas biotecnologias de
reprodução assistida. A presença das células do cumulus é benéfica para
a obtenção de embriões após a FIV, pois oócitos desnudos têm uma taxa
de clivagem baixa (FATEHI
et al.,
2005). FUKUI & SAKUMA (1980) observaram que em bovinos não houve
diferença na maturação in vitro em oócitos de diferentes qualidades,
mas quando os oócitos eram recuperado de folículos de menor diâmetro (≤
4 mm), possuíam qualidade superior aos de maior diâmetro (> 4 mm).
BLONDIN & SIRARD (1995) observaram em bovinos que a competência
para o desenvolvimento embrionário in vitro somente foi afetada por
altos níveis de atresia nas células do cumulus. Os oócitos com células
do cumulus exibindo sinais médios de atresia tiveram taxas maiores de
desenvolvimento embrionário que oócitos sem sinais de atresia.
A condição fisiológica da doadora, como peso, raça, idade e variação
individual, tem merecido atenção em diversos estudos. RUBIANES &
MENCHACA (2003), trabalhando com ovários de cabras de matadouro, não
encontraram diferenças na qualidade dos oócitos entre animais jovens (a
partir de dezoito meses) e senis (até dezessete anos), embora tenham
notado redução na produção de gametas nos animais mais velhos.
CAROLAN
et al. (1996) não
observaram influência do diâmetro folicular sobre a maturação do oócito
em bovinos. Resultado similar foi observado por SENEDA
et al. (2001), ao estudarem oócitos bovinos oriundos de folículos pequenos (< 4 mm) e grandes (> 4 mm) aspirados in vivo.
Por outro lado, em bovinos, os oócitos contidos em folículos maiores
possuem melhor competência para o desenvolvimento in vitro (PAVLOK
et al., 1992; LONERGAN
et al., 1994; HENDRIKSEN
et al., 2000). RAUBER
et al.
(2003) citaram que, provavelmente, as substâncias estimuladoras estejam
presentes nos folículos grandes e médios e ausentes ou presentes em
menor concentração em folículos pequenos. Já CASTILHO
et al.
(2007), estudando o diâmetro e a fase de desenvolvimento folicular em
bovinos da raça Nelore, concluíram que o desenvolvimento folicular
influencia a competência oocitária para o desenvolvimento in vitro,
observando que, nos estádios iniciais da onda folicular, a produção de
blastocisto foi maior em oócitos de folículos pequenos e, com o avanço
da onda, a produção de blastocistos foi maior em oócitos obtidos de
folículos maiores.
FIGUEIREDO
et al. (1997)
concluíram que, além do fator individual, outro aspecto de ordem
biológica a ser considerado como possível variável na FIV é a interação
folículo-oócito. RHODES
et al. (1997), DAYAN
et al. (2000) e ALVES
et al.
(2006), estudando a competência do oócito com aspectos indiretamente
ligados ao diâmetro folicular, a relação entre componentes do fluido e
diâmetro folicular, a interação entre diâmetro do folículo e qualidade
do cumulus oophorus, respectivamente, afirmaram que há uma escassez na
literatura quanto à influência do diâmetro do folículo sobre a
qualidade e competência do oócito para o desenvolvimento, quando o
oócito é obtido pela técnica de Ovum Pick-Up guiada por laparoscopia
(LOPU).
CONCLUSÃO
Os resultados indicam que não houve influência do diâmetro folicular
sobre a qualidade dos complexos cumulus-oócitos (COC’s) recuperados de
ovários de fêmeas ovinas e caprinas oriundas de abatedouros, em fase
aleatória do ciclo estral.
AGRADECIMENTOS
À Empresa Suimax, por disponibilizar os animais necessários à execução deste experimento.
REFERÊNCIAS
ADAMS, G. P.; MATTERI, R. L.; KASTELIC, J. P.; KO, J.
C. H.; GINTHER, O. J. Association between surges of follicle-stimulating
hormone and the emergence of follicular waves in heifers. Journal
of Reproduction and Fertility, v. 94, p. 177-188, 1992.
ALVES, D. F.; RAUBER, L. P.;
RUBIN, F. B. Desenvolvimento embrionário in vitro de oócitos bovinos
mantidos em líquido folicular ou TCM-hepes. Brazilian Journal Veterinarian Research and Animal Science, v. 40, n. 4, p. 279-286, 2006.
BALDASSARRE, H.; FURNUS, C. C.; DE MATOS, D. G.;
PESSI, H. In vitro production of sheep embryos using laparoscopic
folliculocentesis: alternative gonadotrophin treatments for stimulation of
oocyte donors. Theriogenology, v. 45, p. 707-717, 1996.
BALDASSARRE, H.; WANG, B.; KAFIDI, N.; KEEFER, C.;
LAZARIS, A.; KARATZAS, C. N. Advances in the production and propagation
of transgenic goats using laparoscopic ovum pick-up and in vitro embryo
production technologies. Theriogenology, v. 57, p. 275-284, 2002.
BARTLEWSKI, P. M.; BEARD, A. P.; COOK, S. J.;
RAWLINGS, N. C. Ovarian follicular dynamics during anoestrus in ewes. Journal
of Reproduction and Fertility, v. 113, p. 275-285, 1998.
BERNARDI, M. L. Produção in
vitro de embriões ovinos. Acta Scientiae Veterinarian, v. 33, n. 1,
p. 1-16, 2005.
BLONDIN, P.; BOUSQUET, D.; TWAGIRAMUGU, H.; BARNERS,
F.; SIRARD, M.A. Manipulation of follicular development to produce
developmentally competent bovine oocytes. Biologic of Reproduction, v.
66, p. 38-43, 2002.
BLONDIN, P.; SIRARD, M. A. Oocyte and follicular
morphology as determining characteristics for developmental competence in sheep
oocytes. Journal of Reproduction and Fertility, v. 62, p. 575-582, 1995.
CAROLAN, C.; LONERGAN, P.; MONGET, P.; MONNIAUX, D.;
MERMILLOD, P. Effect of follicle size and quality on the ability of follicular
fluid to support cytoplasmatic maturation of bovine oocytes. Molecule
Reproduction Development, v. 43, p. 477-483, 1996.
CASTILHO, C.; ASSIS, G. S.;
GARCIA, J. M. Influência do diâmetro e da fase folicular sobre a competência in
vitro de oócitos obtidos de novilhas da raça Nelore. Arquivo Brasileiro
de Medicina Veterinária e Zootecnia, v. 59, n. 2, p. 288-294, 2007.
CASTILHO, C.; GARCIA, J. M.
Divergência no crescimento folicular: efeito na competência oocitária para o
desenvolvimento in vitro de embriões – revisão. Archives of
Veterinary Science, v. 10, n. 3, p. 17-23, 2005.
CHENG, W. T. K.; MOOR, R. M.; POLGE, C. In
vitro fertilization of pig and sheep oocytes matured in vivo and in
vitro. Theriogenology, v. 25, p. 146, 1986.
CROZET, N.; HUNEAU, D.; DE SMEDT, V.; THÉRON, M-C.;
SZÖLLÖSI, D.; TORRÈS, S.; SÉVELLEC, C. In vitro fertilization
with normal development in the sheep. Gamete Research, v.
16, p. 159-170, 1987.
DAYAN, A.; WATANABE, M. R.;
WATANABE, Y. F. Fatores que interferem na produção comercial de embriões. Arquivo
da Faculdade de Veterinária da UFRGS, v. 20, n. 2, p. 181-185, 2000.
EVANS, A. C. O.; DUFFY, P.; HYNES, N.; BOLAND, M. P.
Waves of follicle development during the estrous cycle in sheep. Theriogenology,
v. 53, n. 3, p. 699-716, 2000.
FATEHI, A. N.; ROELEN, B. A. J.;
COLENBRANDER, B.; SCHOEVERS, E. J.; GADELLA, B. M.; BEVERS, M. M.; VAN DEN
HURK, R. Presence of cumulus cells during in vitro
fertilization protects the bovine oocyte against oxidative stress and improves
first cleavage but does not affect further development. Zygote, v. 13,
n. 2, p. 177-185, 2005.
FIGUEIREDO, R. A.; BARROS,
C. M.; PINHEIRO, O. L.; SOLER, J. M. P. Ovarian follicular dynamics in Nelore
Breed (Bos indicus). Theriogenology, v. 47, p. 1489-1505, 1997.
FUKUI, Y.; SAKUMA, Y. Maturation of bovine oocytes
cultured in vitro: relation to ovarian activity, follicular size and the
presence or absence of cumulus cells. Biology of Reproduction, v.
22, p. 669-673, 1980.
GIBBONS, A.; PEREYRA BONNET,
F.; CUETO, M. I.; SALAMONE, D.; CATALA, M. Colheita de oócitos guiadas por
laparoscopia em caprinos e ovinos. Acta
Scientiae Veterinariae, v.
36, Supl., p. 223-230, 2008.
HANADA, A. In vitro fertilization in goats. Journal
of Animal Reproduction, v. 31, p. 21-26, 1985.
HENDRIKSEN, P. J. M.; VOS, P. L. A. M.; STEENWEG, W.
N. M.; BEVERS, M. M.; DIELEMAN, S. J. Bovine follicular development and its
effect on the in vitro competence of oocytes. Theriogenology, v.
53, n. 1, p. 11-20, 2000.
IZQUIERDO, D.; VILLAMEDIANA, P.; PARAMIO, M. T. Effect
of culture medium on embryo development on pre-pubertal goat IVM-IVF oocytes. Theriogenology,
v. 52, p. 847-861, 1999.
KRUIP, T. A.; BONI, R. Potential
use of ovum pick-up for embryo production and breeding in cattle. Theriogenology,
v. 42, p. 675-684, 1994.
KRUIP, T. A.; DIELEMAN, S. J. Steroid hormone
concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and
stage of the estrus cycle. Theriogenology, v. 24, p. 395-408, 1985.
LONERGAN, P.; MONAGHAN, P.; RIZOS, D. Effect of
follicle size on bovine oocyte quality and development competence following
maturation, fertilization and culture in vitro. Molecule Reproduction
Development, v. 37, p. 48 -53, 1994.
PAVLOK, A.; LUCANS-HAHN, A.; NIEMANN, H. Fertilization
and developmental competence of bovine oocytes derived from different
categories of antral follicles. Molecule Reproduction Development, v.
31, p. 63-67, 1992.
PTAK, G.; DATTENA, M.; LOI, P.; TISCHNER, M.; CAPPAI,
P. Ovum pick-up in sheep: efficiency of in vitro embryo
production, vitrification and birth of offspring. Theriogenology, v.
52, p. 1105-1114, 1999.
RAUBER, L. P.; ALVES, D. F.;
FIGUEIRÓ, G. M.; BRUM, D. S.; HILGERT, T. F.; BERNARDI, M. L.; SILVA, C. A. M.;
RUBIN, M. I. B. Desenvolvimento embrionário de oócitos bovinos mantidos em
fluido folicular bovino de folículos de diferentes diâmetros. Brazilian Journal Veterinary Research and Animal Science, v. 40, p. 169-177, 2003.
RAVINDRA, J. P.; RAWLINGS, N. C. Ovarian follicular
dynamics in ewes during the transition from anoestrus to the breeding season. Journal
of Reproduction and Fertility, v. 110, p. 279-289, 1997.
RHODES, F. M.; PETERSON, A. J.; JOLLY, P. D.;
MCMILLAN, W. H.; DONNISON, M.; LEDGARD, A.; PARTON, G.; HALL, D. R. Bovine
ovarian follicle and oocyte characteristics after emergence of the first
follicular wave. Theriogenology, v. 47, n. 1, p. 149, 1997.
RUBIANES, E.; MENCHACA, A. The pattern and
manipulation of ovarian follicular growth in goats. Animals Reproduction
Science, v. 78, p. 271-287, 2003.
SENEDA, M. M.; ESPER, C. R.; GARCIA, J. M.; OLIVEIRA,
J. A.; VANTINI, R. Relationship between follicle size and ultrasound-guided
transvaginal oocyte recovery. Animals Reproduction Science, v. 67, p.
37-43, 2001.
TERVIT, H. R. Laparoscopy/laparotomy oocyte recovery
and juvenile breeding. Animal Reproduction Science, v. 42, p. 227-238,
1996.
TERVIT, H. R.; WHITTINGHAM, D. G.; ROWSON, L. E. A.
Successful culture in vitro sheep and cattle ova. Journal of
Reproduction and Fertility, v. 30, p. 493-497, 1972.
VASSENA, R.; MAPLETOFT, R. J.;
ALLODI, S.; SINGH, J.; ADAMS, G. P. Developmental competence of bovine oocytes
relative to follicular status. Theriogenology, v. 15, p. 923-932, 2003.
VIÑOLES, C.; FORSBERG, M.; BANCHERO, G.; RUBIANES, E.
Ovarian follicular dynamics and endocrine profiles in Polwarth ewes with high
and low body condition. Animal Science, v.
74, p. 539-545, 2002.
Protocolado
em: 30 abr. 2009. Aceito em: 13 out.
2009.