INFLUÊNCIA DA
REFRIGERAÇÃO NA PRESERVAÇÃO DO NÚMERO
TOTAL DE HEMÓCITOS DE CAMARÕES MARINHOS Litopenaeus
vannamei CULTIVADOS UTILIZANDO-SE
CITRATO DE SÓDIO
Andréa
Christianne Gomes Barretto1, Lilian Maria Nery de Barros Góes2,
Dulcilene Lacerda do Nascimento3, Paulo de Paula Mendes1,
Eneida Willcox Rêgo1, Emiko Shinozaki Mendes1
RESUMO
Para
a realização de contagens de células sanguíneas, faz-se
necessário o uso de anticoagulantes e, no caso específico
da hemolinfa de camarões, ainda não há uma solução padrão para que não
ocorra a
coagulação. Emprega-se frequentemente o citrato de sódio como
anticoagulante,
uma vez que foi verificada a sua eficácia na preservação dos hemócitos
de
camarões marinhos Litopenaeus vannamei.
Em 140 amostras de hemolinfa com citrato de sódio (10%), na proporção
de 1:1,
coletadas em dois ciclos de cultivo, no período seco e no chuvoso,
realizaram-se CTH imediatamente após a coleta e após um período de
armazenamento sob-refrigeração. Todos os dados obtidos foram analisados
utilizando-se as técnicas de modelagens matemáticas (P < 0,05).
Observou-se
que, após o armazenamento sob refrigeração, o número de células
diminuiu
consideravelmente, podendo-se concluir que o anticoagulante citrato de
sódio
somente preserva adequadamente a hemolinfa do camarão Litopenaeus
vannamei para a CTH realizada imediatamente após a
coleta.
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INFLUENCE OF REFRIGERATION ON THE
PRESERVATION OF THE TOTAL NUMBER OF HEMOCYTES
OF SEA SHRIMPS Litopenaeus vannamei CULTIVATED
USING SODIUM CITRATE
ABSTRACT
For carrying out blood cell
count, the use anti-coagulants is necessary, and in the specific case
of the hemolymph in shrimp, there is still
no standard
solution to avoid its coagulation. Sodium citrate is frequently used as
anti-coagulant, because it has been previously proven to be efficient
in the
preservation of the hemocytes of the sea shrimp Litopenaeus
vannamei. In 140 samples of hemolymph with sodium
citrate (10%) in the ratio of 1:1, collected at 2 stages of
cultivation, in dry
and wet season, were examined for HTC immediately after collection and
then
again after storage in the refrigerator. All data were analyzed using
modeling
mathematics formulas (P < 0.05). After storage in the refrigerator,
the
number of cells decreased considerably. Therefore, the anticoagulant
sodium
citrate only preserved the hemolymph of the shrimp Litopenaeus
vannamei for HTC when the count was done immediately
after collection.
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INTRODUÇÃO
A hematologia vem se tornando, para a aquicultura, um
precioso
instrumento para que se conheçam as alterações fisiológicas que ocorrem
nos
organismos cultivados, causadas, principalmente, por fatores internos,
como
sexo, estágio de maturação gonodal, idade, modo de vida e pelas
alterações de
fatores de água. No entanto, ainda são escassos artigos sobre o tema, o
que
dificulta maior discussão a respeito dessa questão (RAZINE-PAIVA &
SILVA-SOUZA, 2004).
Em se tratando do camarão marinho, esse animal é considerado
primitivo no
que concerne ao sistema imunológico. Todavia, ele apresenta mecanismos
de
defesa eficientes e é capaz de resistir e eliminar uma variedade de
patógenos,
preservando, dessa forma, a sua integridade (OLAFSEN,1988).
Os crustáceos, assim como os demais invertebrados, são
desprovidos do
sistema imune adaptativo altamente específico, composto pelos
linfócitos T e B,
receptores, anticorpos e memória imunológica de longo prazo, existentes
nos
vertebrados, apresentando apenas o sistema imune inato ou natural (Barracco et al., 2008).
As reações de defesa dos invertebrados estão relacionadas à
sua hemolinfa.
Esta é caracterizada por se constituir em um tecido fluido composto por
uma
fração celular, os hemócitos, e uma fração líquida, o plasma
(GONÇALVES, 2011).
Entende-se por anticoagulantes substâncias utilizadas para
prevenir a
coagulação sanguínea bem como retardar a deteriora do sangue, e a
escolha
inapropriada pode interferir nas investigações bioquímicas e nas
determinações
quantitativas. O citrato de sódio é bastante utilizado em transfusões e
hemossedimentação, pois atua combinando-se com o cálcio, formando,
assim, o
citrato de cálcio insolúvel. Além disso, o citrato de sódio é bastante
utilizado em diversas práticas nos camarões, embora ele possa
interferir em
muitos testes bioquímicos (STOCKHAM, 2011).
De acordo com BACHÉRE (2000), nos últimos anos, o
desenvolvimento de
soluções anticoagulantes específicas possibilitou avanços nos estudos
dos
hemócitos de crustáceos. PERAZZOLO et al. (2002) e ALBORES et al.
(2005)
desenvolveram soluções anticoagulantes compostas por várias
substâncias, porém
de difícil aplicação em fazendas, devido às condições do seu preparo.
Assim
sendo, objetivou-se avaliar a eficácia do anticoagulante citrato de
sódio na
preservação dos hemócitos de camarões marinhos Litopenaeus
vannamei cultivados, para a leitura imediata e em associação
com a refrigeração.
MATERIAL E MÉTODOS
Após a captura, os camarões foram transportados vivos ao
laboratório da
propriedade e examinados clinicamente, de acordo com o método
preconizado por
MORALES-COVARRUBIAS (2010). Posteriormente, coletou-se 0,1mL hemolinfa
de cada
animal, por meio de seringa estéril, contendo 0,1mL do anticoagulante
citrato
de sódio a 10%. A hemolinfa foi extraída por punção na região ventral
do
abdômen. Os animais foram divididos em dois grupos distintos para a
realização
do estudo e, como critério para separação, utilizou-se a divisão a
partir do
sexo, separando-os em machos e fêmeas.
O experimento foi desenvolvido sob a aprovação da comissão de
ética no
uso de animais da UFRPE, sob processo no 019127, tendo sido
respeitados todos os preceitos éticos de proteção dos animais.
As contagens totais de hemócitos (células/mm3)
foram
realizadas imediatamente após a coleta e cinco horas após a
refrigeração a 4o
C, de forma semelhante à utilizada para eritrócitos de mamíferos
(SCHALM, 1974)
em câmara de Neubauer, sendo, contudo, adaptada para hemolinfa diluída
em
citrato de sódio, na proporção de 1:1, através da seguinte fórmula:
Para se correlacionar os resultados da contagem total de
hemócitos (CTH)
nos camarões amostrados em função do tempo, ou seja, imediatamente após
a
coleta e cinco horas após a coleta das amostras refrigeradas do viveiro
(A e
B), dos ciclos de cultivo (1º e 2º ciclos), da higidez dos animais
amostrados
(ENF), do peso dos animais e do tempo de cultivo (TC), adotou-se o
seguinte
modelo matemático:
Em que se lê: CTH – contagem total de hemócitos; β0, β1,...β5 - parâmetros do modelo; mc
– contagem
de hemócitos no momento da coleta; V – viveiro; CL – ciclo de cultivo;
ENF –
enfermidade, TC - tempo de cultivo dos camarões; ε - erro associado a cada observação; i –
i-ésima observação.
Para se estimar os parâmetros do referido modelo, empregou-se
a técnica
dos mínimos quadrados e, para se selecionar as variáveis significativas
no
modelo (P< 0,05), utilizou-se o processo de Stepwise,
de acordo com MENDES et al. (2006). Todas as variáveis
foram incluídas no modelo sob a forma de variável binária (0 ou 1), com
exceção
da variável tempo de cultivo e peso. Associado ao processo Stepwise,
foi utilizado o transformador de Box e Cox (BOX &
COX, 1964), objetivando minimizar a variância experimental. Na realização dos cálculos, empregou-se o
pacote Estatístico SysEapro versão 1,0.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Observa-se,
na Figura 1, que
os camarões machos obtiveram maiores contagens nas amostras processadas
imediatamente após as coletas, demonstrando que essas amostras não
devem ser
armazenadas para posterior contagem. Pode-se observar também que, além
da
refrigeração, a variável peso foi significativa no referido modelo.
Em
se tratando das fêmeas,
observa-se, na Figura 2, que as maiores
contagens também foram obtidas quando
as amostras foram processadas imediatamente após as coletas. E,
diferentemente
dos machos, a outra variável significativa em relação às fêmeas foi o
tempo de
cultivo.
De
acordo com os valores
preconizados pelo Centro de Serviços para a Aquicultura (CSA, 2006), as
médias
dos valores obtidos são consideradas boas quando os hemócitos foram
contados
imediatamente após a coleta, ficando entre 10-15 x 106 hem/
mm3.
As amostras processadas após um período sob refrigeração apresentaram
contagens
consideradas baixas ou muito baixas, girando em torno de 5 x 106
cel/ mm3, o que significa que o armazenamento em temperatura
de
refrigeração deve ser evitado quando se utilizar o citrato de sódio
como
anticoagulante para a realização de contagem de hemócitos.
Em
relação ao tempo de
cultivo, pôde-se observar influência positiva sobre as contagens, o que
pode
ser um indicativo de que animais mais jovens apresentam menores
concentrações
celulares que animais mais velhos, semelhante ao que ocorre em
mamíferos
(THRALL, 2006).
Esses
resultados são
discordantes dos encontrados por OWENS & O’NEILL (1997), os quais,
ao
trabalharem com Penaeus monodon, não
observaram diferença entre a CTH em diferentes fases de vida.
As
alterações detectadas
durante o exame a fresco − lesões
nos túbulos do hepatopâncreas e presença de parasitas −
não interferiram significativamente nas contagens (P > 0,05),
assim como os viveiros onde estavam sendo cultivados os camarões e a
época da
coleta (seco e chuvoso). Existe, contudo, uma dificuldade de se
comparar
resultados de CTH com as demais pesquisas e revisões da área, pois os
métodos
adotados são extremamente diferentes, como afirmado por VAN DE BRAAK et
al.
(1996).
Ao
se comparar as contagens
encontradas nos machos com as encontradas nas fêmeas, observou-se que
eles
apresentaram cerca de 31% de células circulantes a mais que as fêmeas.
Isso
pode ter ocorrido devido ao fato de os machos serem maiores que as
fêmeas e,
consequentemente, refletirem uma maior capacidade de se protegerem
contra
agentes patógenos.
BARRACCO
(2004) afirmou que a
CTH pode aumentar ou diminuir seus valores, dependendo do tempo e do
tipo de
estresse. Nas injúrias e nos processos infecciosos, usualmente ocorre a
diminuição durante as primeiras horas, havendo, em seguida, um aumento
de seus
valores, possivelmente devido à liberação de novas células a partir dos
órgãos
hematopoiéticos.
De
acordo com PERAZOLLO
(1994), não há interferência do sexo sobre a contagem total de
hemócitos na
espécie Penaeus paulensi, porém vale
ressaltar que, no referido trabalho, além de ter sido utilizada uma
espécie
diferente, foram utilizados pools das
amostras, o que provavelmente veio a interferir no resultado da
pesquisa.
CONCLUSÕES
O
armazenamento por 5 horas
em condição de refrigeração a 4oC da hemolinfa com o
anticoagulante
citrato de sódio a 10% não é indicado para a contagem total de
hemócitos,
devido à não preservação das células.
BACHÉRE, E.
Shrimp immunity and disease control. Aquaculture, Amsterdam, v.
191, p.3-11. 2000.
BARRACCO, M.A. Mecanismo de
resistência a
doenças
Barracco,
M.A.;
Perazzolo, L.M.; Rosa, R.D. Inmunología del camarón. In:
Vielka
M.Q., Cuéllar-Anjel J. Guía técnica - Patología y Inmunología de
camarones.
Panamá:
Ed. CYTED,
2008. p. 169-224.
BOX, G. E. P.;
COX, D. R. An analysis of
transformation. Journal of Royal Statistic Society,
[s.l.], Ser.B, v. 26, 1964, p. 211 – 243.
CSA. CENTRO DE SERVIÇOS PARA
GONÇALVES, P. Expressão de
genes
imunológicos associados à defesa antifúngica em Litopenaeus
vannamei infectados
experimentalmente com Fusarium solani. 2011. 106f.
Dissertação
(Mestrado em Aquicultura). Universidade Federal de Santa Catarina,
Florianópolis. Disponível em http://repositorio.ufsc.br/xmlui/bitstream/
handle/123456789/95953/299994.pdf?sequence=1, acesso em
05 de novembro de 2012.
MENDES, P.P. et
al. Análise
estatistica dos parâmetros aquicolas, com fins a
otimização da produção. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE
ZOOTECNIA,
43, 2006, João Pessoa. Anais... João
Pessoa SBZ, 2006. v.35, p.886-903. Disponível em http://www.sbz.org.br/reuniaoanual/anais/arq_reuniao_anual/
sbz2006.rar, acesso
em 05 de novembro de
2012.
MORALES-COVARRUBIAS, M.S. Enfermidades Del camarón: detection
mediante análisis em fresco e histopatología. (Diseases shrimp
detection by means of Gross
analysis and histopathology). México: Ed. Trilhas, 2010. 23p.
OLAFSEN, J.A.
Role of lectins in invertebrate humoral defense. Newsletter
American Fisheries Society, Washington, US, v.1, p.189-
2005, 1988.
OWENS, L.;
O’NEILL, A. Use of a clinical cell flow cytometer for differential
counts of
prawn Penaeus monodon haemocytes. Diseases
of Aquatic Organisms, Hawaii,
USA, v.31, p.147-153. 1997.
PERAZZOLO, L.
M.; GARGIONE, R ; OGLIARI, P. ; BARRACCO, M.A. Evaluation of some
hemato-immunological parameters in the shrimp Farfantepenaeus
paulensis submitted to environmental and
physiological stress. Aquaculture, Amsterdam, v. 214, p. 19-33.
2002.
RANZINE-PAIVA, M.J. T.;
SILVA-SOUZA, A.T.
Hematologia de peixes brasileiros. In: RANZINE-PAIVA, M.J.T.; TAKEMOTO,
R.M;
LIZAMA, M.A.P. (Org). Sanidade de
organismos aquáticos. São Paulo: Varela, 2004. 88-120p.
SCHALM, O.W. Veterinary
Hematology. 3 ed. Philadelphia: Lea e Febiger, 1974. 807p.
STOCKHAM, S.L. Fundamentos
de Patologia Clínica Veterinária. Rio de Janeiro, RJ:
Guanabara Koogan, 2011. 314p.
THRALL, M. A., Hematologia
e bioquímica veterinária- São Paulo: Roca, 2006.
VAN DE BRAAK, C.B.T.; FABER, R.; BOON, J.H. Celular and humoral characteristics of Penaeus Monodon (Fabricius, 1798) haemolymph. Comparative Hematology International, London: Springer-Verlag, v.6, p.194-203. 1996.
Protocolado em: 03 mar.
2009. Aceito em: 26 out. 2012.