A mastite é uma enfermidade que
acomete principalmente animais com aptidão leiteira, ocasionando uma
série de prejuízos aos produtores de ovinos de leite e corte.
Objetivou-se avaliar o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos
principais agentes causadores de mastite em ovelhas. Foram analisadas
163 amostras de leite, sendo utilizado o teste Whiteside Modificado
(WSM), além do cultivo das amostras em ágar sangue ovino 5% (AS). Das
163 amostras analisadas, observou-se que 23,31% e 14,72% foram
positivas e fortemente positivas, respectivamente, no teste WSM. Os
principais agentes isolados foram Staphylococcus spp. (31,39%), Acinetobacter spp. (10,50%), Enterobacter aerogenes (10,50%), Escherichia coli (8,20%) e Aeromonas
spp. (6,70%). O perfil de sensibilidade aos antimicrobianos apresentou
grande variação, com a novobiocina demonstrando o menor percentual de
sensibilidade (10,46%). A maior taxa de susceptibilidade foi observada
para a associação de lincomicina com estreptomicina (86,02%). Neste
estudo, observou-se que os Staphylococcus
spp. são os agentes comumente envolvidos nos casos de mastite
subclínica em ovelhas. A associação entre lincomicina e estreptomicina
e josamicina e trimetoprim constituiu as drogas mais eficientes nos
testes de sensibilidade in vitro contra os agentes da mastite ovina.
PALAVRAS-CHAVES: Mastite, microrganismos, resistência antimicrobiana, teste Whiteside.
BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION AND
PROFILE OF ANTIBIOTICS SENSIBILITY TO BACTERIA AGENTS RESPONSIBLE FOR
OVINE SUBCLINICAL MASTITIS IN WEST REGION OF THE SANTA CATARINA
Ovine mastitis is an infectious
disease associated to economic losses in dairy and meat sheep. The
present study aims to determine the antimicrobial drug patterns of the
most frequent etiologic agents of ovine mastitis. We analyzed 163 milk
samples using Whiteside test, besides the bacteriological culture in
ovine blood agar 5% (AS). From 163 analyzed samples 23.31% and 14.72%
were positive and strongly positive, according to the Whiteside
test. The most frequent etiologic agents of ovine mastitis isolated in
the present study were: Staphylococcus spp. (31.39%), Acinetobacter spp. (10.50%), Enterobacter aerogenes (10.50%), Escherichia coli (8.20%) and Aeromonas
spp. (6.70%). The sensitivity patterns to antimicrobial drugs showed
high variation. The small sensitivity was observed to novobiocin
(10.46%). The higher sensitivity was detected to lyncomicin +
streptomicin association (86.02%). In our study we conclude that Staphylococcus
spp. are the most frequent bacterial agents envolved in subclinical
mastitis in sheep. The association of lyncomicin + streptomicin and
josamicin + thrimetoprin were more efficient in vitro sensitivity tests.
KEY WORDS: Mastitis, microorganisms, antimicrobial resistance, Whiteside test.
A mastite é a inflamação da glândula
mamária, que ocasiona alterações físicas, químicas e bacteriológicas no
leite, além de produzir alterações no tecido da glândula mamária (BLOOD
et al., 1994). A incidência
anual da mastite clínica em pequenos ruminantes está geralmente abaixo
de 5%, podendo aumentar esporadicamente. Por outro lado, a prevalência
de mastite subclínica tem sido estimada entre 5% a 30% (BERGONIER &
BERTHELOT, 2003; CONTRERAS et al.,
2003). As perdas na produção de leite e aumento na contagem de células
somáticas (CCS) em cabras e ovelhas infectadas têm sido amplamente
documentados (LEITNER et al., 2004), e parece que ovelhas possuem maior vulnerabilidade que cabras para perdas no rendimento de leite (SILANIKOVE et al., 2005).
Vários patógenos podem causar mastite, mas Staphylococcus
spp. são diagnosticados com maior frequência como causa de infecções
intramamárias em cabras e ovelhas. Outros patógenos como o Streptococcus spp., microrganismos da família Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Mannheimia haemolytica, corinebactérias e fungos podem produzir infecções intramamárias em pequenos ruminantes, mas em menor proporção (BERRIATUA et al., 2001; BERGONIER & BERTHELOT, 2003; CONTRERAS et al., 2003; GONZALO et al., 2004).
Infecções intramamárias causadas por S. aureus
têm merecido atenção especial, pois essa bactéria é responsável por
dois tipos graves de mastite: a mastite gangrenosa e a subclínica. S. aureus
produz algumas toxinas importantes que contribuem para a patogênese da
mastite e também estão associadas a doenças alimentares, mesmo com
leite pasteurizado, devido à contaminação por enterotoxinas
termoestáveis (CONTRERAS et al., 2007). Staphylococcus
coagulase negativa (CNS) possuem maior prevalência na etiologia da
mastite subclínica em ruminantes leiteiros. Embora menos patogênico que
Staphylococcus aureus, CNS
podem também produzir mastite subclínica persistente, significativo
aumento de CCS e mastite clínica, além de produzir enterotoxinas
termoestáveis (DEINHOFER & PERNTHANER, 1995; UDO et al., 1999).
O diagnóstico das mastites em ovelhas pode ser realizado na propriedade
através de testes como o CMT (California Mastitis Test) e também o
Whiteside. Ambos os testes possuem o mesmo mecanismo de ação e são
usados para acompanhar casos de mastite subclínica no rebanho, e tem
como fundamento a detecção do aumento do número de leucócitos e células
de descamação. O Teste Whiteside (TWS) e o California Mastitis Test
(CMT) detectam indiretamente a presença ou o aumento do número de
leucócitos no leite (HUESTON et al.,
1986). Outro teste usado na detecção de mastite em animais é a contagem
de células somáticas (CCS) no leite. Este método é realizado em
laboratório e apresenta resultados fidedignos (CLEMENTS et al., 2003).
Várias drogas antimicrobianas têm sido empregadas no tratamento da
mastite ovina, no entanto, poucos são os trabalhos sobre o perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados bacterianos causadores
da enfermidade. De acordo com CONTRERAS et al.
(2007), a terapia intramamária da mastite ovina é realizada com drogas
de indicação para a espécie bovina, dada a escassez de produtos para
pequenos ruminantes. Assim, a diversidade dos agentes da mastite ovina
e a sua crescente resistência aos antimicrobianos convencionais alertam
para a necessidade da realização de testes de sensibilidade in vitro,
visando à terapia correta para os casos de mastite na propriedade.
O presente estudo teve por objetivo avaliar o perfil de sensibilidade
aos antimicrobianos dos principais agentes causadores de mastite em
ovelhas clinicamente saudáveis.
A coleta das amostras de leite foi
realizada durante o período de setembro a novembro de 2006. O estudo
foi realizado em nove propriedades rurais da região oeste do estado de
Santa Catarina, entre os quais Xanxerê, Chapecó, Bom Jesus, Xaxim,
Lageado Grande, Marema e Cordilheira Alta. Os animais utilizados no
trabalho possuíam aptidão mista (carne e leite), sendo explorados em
sistema extensivo. Utilizaram-se 84 fêmeas ovinas mestiças, entre a
segunda e a quinta lactação.
Coletaram-se as amostras de leite após lavagem da glândula mamária e
secagem com papel toalha, sendo desprezados os três primeiros jatos.
Foram utilizados frascos estéreis, identificados e acondicionados sob
refrigeração (4ºC) em caixas isotérmicas até sua chegada no Laboratório
de Microbiologia da UNOESC. De cada animal, coletaram-se duas amostras,
uma de cada teto, totalizando 163 amostras de leite avaliadas.
No laboratório, com o auxílio de uma pipeta estéril, foi realizado o
teste Whiteside Modificado (NaOH 4%), na proporção de quatro partes de
leite para uma parte de reagente. Usou-se o Whiteside para quantificar
a resposta inflamatória presente nas amostras, sendo interpretado da
seguinte forma: negativa (ausência de grumos), (+) fracamente positiva
(poucos grumos), (++) positiva (moderado número de grumos) e (+++)
fortemente positiva (elevado número de grumos).
Para o isolamento bacteriano, as amostras foram semeadas em ágar sangue
ovino a 5%, com o auxílio de uma alça de platina e após levadas para a
estufa a 37ºC. efetuou-se a leitura das placas em 24 e 48 horas, e
identificaram-se os agentes bacterianos por meio de características
morfológicas, bioquímicas e tintoriais (QUINN
et al., 1994).
Determinou-se o perfil de sensibilidade dos microrganismos por meio do
método de difusão em disco Kirby-Bauer modificado (NCCLS, 1999). Os
isolados foram semeados em Müller Hinton caldo e incubados a 37ºC até
obtenção de turvação conforme a escala 0,5 de Mac Farland. Com auxílio
de um swab, semearam-se os isolados em placas de Petri contendo Müller
Hinton ágar. Logo após, foram aplicados os discos impregnados com as
drogas antimicrobianas que incluíram: novobiocina (30µg), lincomicina
(2µg), eritromicina (15µg), amoxicilina (10µg), josamicina (30µg),
ceftiofur (30µg), josamicina associada à trimetoprim, doxiciclina (30
µg), cefalexina (30 µg) e lincomicina associada à estreptomicina.
Incubaram-se as placas em estufa durante 24 horas a 37ºC. Após a
leitura dos halos, foi determinado o perfil de sensibilidade dos
isolados.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Das 163 amostras analisadas, observou-se que 23,31% (38/163) e 14,72%
(24/163) foram positivas e fortemente positivas, respectivamente, no
teste Whiteside, indicando um aumento do número de células somáticas.
Tais dados revelam uma frequência de mastite subclínica de 38% nos
rebanhos estudados. As amostras sem crescimento bacteriano em cultivo
corresponderam a 53,37% (87/163), das quais 42,53% (37/87) apresentaram
resultado negativo no teste Whiteside e 39,08% (34/87) foram fracamente
positivas para este teste. Os resultados positivos no Whiteside, mas
negativos no exame microbiológico, podem indicar um processo
inflamatório de origem não bacteriana, pois, segundo GONZÁLEZ-RODRÍGUEZ
& CÁRMENES (1996), o Whiteside é um teste importante no diagnóstico
de mastite subclínica em ruminantes.
Com relação aos resultados da lactocultura, 53,37% (87/163) das
amostras apresentaram resultado negativo e 46,63% (56/163) mostraram
crescimento bacteriano. Os microrganismos isolados das 163 amostras de
leite de ovelha encontram-se na
Tabela 1, sendo observada maior frequência de
Staphylococcus spp. (31,39%). O isolamento de microrganismos do gênero
Staphylococcus spp. reforça a sua importância na etiologia de mastite subclínica (CONTRERAS
et al., 2007). MARGUET
et al. (2000) avaliaram vários casos de mastite subclínica em ovelhas, sendo isolados apenas microrganismos do gênero
Staphylococcus spp. COUTINHO
et al. (2006) realizaram um estudo etiológico da mastite ovina no Estado da Bahia, sendo observada elevada frequência de
Staphylococcus coagulase negativa (57,6%), seguido do
S. aureus (15,2%),
Micrococcus spp., (15,2%) e
Streptococcus spp. (12%).
Neste trabalho foram isolados agentes pertencentes à família
Enterobacteriaceae, tais como
Escherichia coli, Enterobacter aerogenes e
Klebsiella spp. O isolamento de microrganismos da família
Enterobacteriaceae
associado à ausência de sinais clínicos nos animais não é um achado
comum, já que as mastites causadas por enterobactérias geralmente
demonstram evidências clínicas. As enterobactérias são consideradas
importantes agentes das mastites ambientais (PRESTES
et al., 2003). Dentre os principais agentes ambientais, a
Escherichia coli destaca-se, em virtude do severo quadro clínico apresentado (BRABES
et al., 2003).
O perfil de sensibilidade dos microrganismos isolados aos
antimicrobianos apresentou grande variação, com a novobiocina
demonstrando o menor percentual de sensibilidade (10,46%), seguida da
eritromicina (16,29%), lincomicina (17,43%), e da amoxicilina (19,77%).
SANTOS (2006), avaliando o perfil de sensibilidade de
Staphylococcus
spp. e enterobactérias isoladas de mastite recorrente em oito rebanhos
da região de Uberlândia-MG, observou que 73,68% dos isolados de
Staphylococcus spp. foram resistentes à eritromicina e 76,92% das enterobactérias isoladas foram resistentes à amoxicilina.
LOLLAI
et al. (2008)
analisaram o perfil e a evolução da resistência antimicrobiana de
patógenos da mastite ovina entre o período de 1995 e 2004,
identificando que a resistência de
Staphylococcus spp. à penicilina pareceu ser menor do que o relatado em outros estudos (4,1% de cepas resistentes de
S. aureus; 15,3% de
Staphylococcus
coagulase negativa). Índices maiores de resistência foram observados
para aminoglicosídeos. Os autores concluíram que o perfil encontrado
parece confirmar a resistência menor dos patógenos de ovinos, quando
comparados aos de origem bovina.
A elevada resistência dos isolados à novobiocina, fato observado neste trabalho, difere do descrito por FREITAS
et al.
(2005), que encontraram maiores taxas de sensibilidade isolados de
mastite para a novobiocina (71%). Contudo, foi observada concordância
para os valores elevados de resistência tanto para a amoxicilina quanto
para a penicilina. A amoxicilina pertence ao mesmo grupo de
antibióticos betalactâmicos e geralmente os isolados de
Staphylococcus
spp. são bastante resistentes (acima de 70%) à penicilina G, bem como
ampicilina e carbenicilina (TAVARES, 2000). Porém, LANGONI
et al.
(2000), avaliando a eficácia do tratamento da mastite por meio da
administração da amoxicilina, enrofloxacina e a associação de ambos,
encontraram 84,6% e 75% de sensibilidade para agentes isolados de casos
de mastite subclínica e clínica, respectivamente.
As maiores taxas de susceptibilidade foram observadas para a associação
de lincomicina com estreptomicina (86,02%), josamicina com trimetoprim
(67,44%) e doxiciclina (61,44%) (
Figura 1).
As associações entre antimicrobianos aumentam as taxas de
susceptibilidade dos isolados bacterianos, devido ao aumento do
espectro de ação, fato este importante, já que a mastite é uma
enfermidade de etiologia múltipla, sendo isolados microrganismos gram
positivos e gram negativos (LANGONI
et al., 2000).
CONCLUSÕES
Neste estudo, observou-se que os
Staphylococcus
spp são os agentes comumente envolvidos nos casos de mastite subclínica
em ovelhas. A associação entre lincomicina + estreptomicina e
josamicina + trimetoprim foi a mais eficiente nos testes de
sensibilidade in vitro contra os agentes da mastite ovina.
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