DOI: 10.1590/1089-6891v20e-50604
MEDICINA VETERINÁRIA

VALORES HEMATOLÓGICOS DE LOBINHOS (Cerdocyon thous) DO PANTANAL, MATO GROSSO DO SUL, BRASIL NATURALMENTE INFECTADOS E NÃO INFECTADOS POR Trypanosoma cruzi E T. evansi

HEMATOLOGICAL VALUES OF CRAB EATING FOXES (Cerdocyon thous) FROM PANTANAL, MATO GROSSO DO SUL, BRAZIL
NATURALLY INFECTED AND NON INFECTED BY Trypanosoma cruzi AND T. evansi

Filipe Martins Santos¹ ORCID - http://orcid.org/0000-0003-2032-8129
Gabriel Carvalho de Macedo¹ ORCID - http://orcid.org/0000-0002-4596-5733
Wanessa Teixeira Gomes Barreto² ORCID - http://orcid.org/0000-0003-2970-1321
Wesley Arruda Gimenes Nantes¹* ORCID - http://orcid.org/0000-0002-3454-4714
William Oliveira de Assis¹ ORCID - http://orcid.org/0000-0003-3327-0800
Heitor Miraglia Herrera¹ ORCID - http://orcid.org/0000-0003-2404-8765

¹Universidade Católica Dom Bosco, Campo Grande, MS, Brasil.
²Universidade Federal do Mato Grosso do Sul, Campo Grande, MS, Brasil.
* Autor para correspondência - wesley_anantes@hotmail.com

Resumo
O objetivo do trabalho foi avaliar a influência do sexo, da sazonalidade e de infecções por Trypanosoma cruzi e Trypanosoma evansi nos valores hematológicos de lobinhos (Cerdocyon thous) que habitam o Pantanal Sul-Mato-Grossense. Entre novembro de 2015 e outubro de 2016, foram amostrados 48 lobinhos. Os valores hematológicos mensurados foram as contagens de eritrócitos e leucócitos, volume globular e volume corpuscular médio. Consideramos como parasitados os animais positivos para T.cruzi e T. evansi em qualquer um dos testes diagnósticos utilizados. Observamos que sete (14.5%) lobinhos encontraram-se parasitados somente por T.cruzi, sete por T. evansi, e nove (19%) estavam coinfectados. Os animais parasitados por T.cruzi mostraram um aumento significativo das contagens de leucócitos (14.7 x 10³) em relação aos animais não parasitados (10.4 x 10³), parasitados por T. evansi (12.4 x 10³) e coinfectados (12.9 x 10³). Observamos diferença significativa em relação aos valores médios de eritrócitos e volume corpuscular médio entre os períodos de cheia e seca: 2.6 x 10⁶ e 165, e 3.4 x 10⁶ e 132, respectivamente. Todos apresentaram macrocitose não confirmada morfologicamente.
Palavras-chave: lobinho, hematologia, silvestres, Trypanosoma

Abstract
The aim of this work was to evaluate the influence of sex, seasonality and infections by Trypanosoma cruzi and Trypanosoma evansi on the hematological values of crab-eating foxes (Cerdocyon thous) that inhabit the Pantanal from Mato Grosso do Sul. Between November of 2015 and October of 2016, 48 animals were sampled. The hematological values measured were erythrocyte and leukocyte counts, globular volume and mean corpuscular volume. We considered as parasitized the positive animals for T.cruzi and T. evansi in any of diagnostic tests used. We observed that seven (14.5%) of the crab-eating foxes were parasitized only by T.cruzi, seven by T. evansi, and nine (19%) were coinfected. The parasitized animals by T.cruzi showed a significant increase in leukocyte counts (14.7 x 10³) compared to non-parasitized animals (10.4 x 10³), parasitized by T. evansi (12.4 x 10³) and coinfected (12.9 x 10³). We observed a significant difference in relation to mean erythrocyte and mean corpuscular volume values between wet and dry periods: 2.6 x 10⁶ and 165, and 3.4 x 10⁶ and 132, respectively. All presented morphologically unconfirmed macrocytosis.
Keywords: Crab-eating Fox, Hematology, Sylvan, Trypanosoma

Recebido em: 10 de dezembro de 2017
Aceito em: 25 de setembro de 2108

Introdução

Os lobinhos (Cerdocyon thous) são mamíferos de porte médio pertencentes à ordem Carnivora, família Canidae e subfamília Caninae. São animais de hábitos crepusculares-noturnos e generalistas em relação à sua dieta, alimentando-se de frutos, insetos, crustáceos, pequenos mamíferos, aves, répteis, anfíbios e ovos de diversas espécies. Atuam como dispersores de sementes, tanto de frutas nativas como cultivadas^(1-5).

Ainda, vivem isoladamente ou em casais, caçam separadamente, de forma não cooperativa.

São amplamente distribuídos no continente sul-americano (Colômbia, Venezuela, Guiana, Suriname, sudeste da Bolívia, Paraguai, Uruguai, nordeste da Argentina e em quase todos os biomas brasileiros), tendo uma grande capacidade de adaptação em ambientes modificados^(6,7). Contudo, a fácil adaptabilidade em ambientes variados promove efeitos negativos para a espécie, principalmente quando o hábitat é compartilhado com seres humanos e animais domésticos, de companhia e de produção. Como resultado desse compartilhamento, diversos parasitas comuns a outras espécies têm sido relatados em lobinhos, como bactérias^(8-10), vírus^(11-13) e protozoários gastrintestinais e sanguíneos^(14-18).

Tanto em ambientes compartilhados por humanos e animais domésticos como nos ambientes naturais, a mensuração de valores hematológicos de animais de vida livre tem sido cada vez mais utilizada como uma ferramenta para a avaliação da saúde. De acordo com Fairbrother e O’loughlin⁽¹⁹⁾, os valores hematológicos são necessários na avaliação de efeitos ambientais, de intoxicações e das doenças infecciosas e parasitárias sobre a condição sanitária desses animais. A contagem de glóbulos brancos pode fornecer informações sobre a resposta imune a um agente infeccioso ou parasitário, ao passo que a série vermelha indica principalmente a presença e o grau de anemia⁽¹⁹⁾.

Alguns grupos de parasitas, como os tripanosomatídeos, podem provocar alterações consideráveis nos parâmetros hematológicos tanto de animais domésticos quanto de animais de vida livre. Alterações na série vermelha e branca já foram descritas em cães e quatis, natural e experimentalmente infectados por Trypanosoma cruzi e Trypanosoma evansi^(20-24). Por outro lado, alguns estudos demonstram que fatores ambientais e de manejo podem influenciar os parâmetros hematológicos tanto quanto as infecções parasitárias⁽²⁵⁾.

O Pantanal é uma grande área úmida de savana continental (147,574 km² no Brasil), tocando a Bolívia ao norte e o Paraguai ao sul⁽²⁶⁾. Caracteriza-se pelo solo arenoso, por uma vegetação em mosaico de floresta semidecídua dispersa e campos inundados sazonalmente, de acordo com as três estações distintas: período seco (agosto a novembro), período cheio (dezembro a março) e período de vazante (abril a junho)⁽²⁷⁾. Com uma densidade populacional humana de <2 pessoas por km², e tendo a pecuária extensiva como principal atividade econômica, o Pantanal abriga uma fauna abundante e densa, a qual inclui também os lobinhos, com uma densidade para o Pantanal de Nhecolândia de 0,24 (planícies inundáveis), 0,41 (floresta) e 0,55 (cerrado) ind/km²⁽²⁸⁾, em censos no período diurno apenas. Outra estimativa para o Pantanal, utilizando áreas de uso obtidas através de radiotelemetria, foi de 0,8 ind/km²⁽²⁹⁾.

Apesar dos diversos estudos voltados para a biologia e parasitas que infectam os lobinhos, pouco se sabe sobre a influência de fatores biológicos, ambientais ou parasitários nos parâmetros hematológicos desses animais que habitam o ambiente natural. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi avaliar se o sexo, a estação do ano e a infecção por T.cruzi ou T. evansi poderiam influenciar nos resultados hematológicos de lobinhos (C. thous) que habitam o Pantanal Sul-Mato-Grossense.

Materiais e métodos

O estudo foi realizado na região sul do Pantanal (18º 59 ‘15’ ‘S, 56º 37’ 03’’O). A área, localizada na região da Nhecolândia, apresenta uma fitofisiologia caracterizada por cordões arenosos de florestas decíduas ou semidecíduas, conhecidas como “cordilheiras” ou “capões” (manchas de floresta cercadas por campos de inundação). As áreas florestadas se caracterizam por porções elevadas do relevo não sujeitas a inundações regulares, entremeadas pela planície de inundação e por lagoas permanentes ou temporárias. O período de amostragem foi de novembro de 2015 a outubro de 2016.

Foram capturados 48 lobinhos em armadilhas do tipo box-trap (90cm x 45cm x 50cm – Equipos Fauna®), utilizando-se bacon e sardinha enlatada como iscas. Posteriormente à captura, os animais foram sedados através de injeção intramuscular de cloridrato de tiletamina e cloridrato de zolazepan (Zoletil, Virbac®), respeitando-se a dose estabelecida para a espécie. De cada animal, foram coletados 4 ml de sangue por meio da venopunção jugular, sendo a amostra sanguínea dividida em duas porções: (i) porção depositada em um tubo de 4 ml (Vacuplast®) contendo ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA K3) para a realização de análises hematológicas, testes parasitológicos e moleculares; (ii) porção depositada em tubo de 4 ml (Vacuplast®) sem anticoagulante para a realização de testes sorológicos. Os animais foram monitorados durante a sedação quanto aos parâmetros fisiológicos (frequência cardíaca, frequência respiratória, temperatura retal, reflexos podais, pupilares) e parâmetros clínicos (hidratação, tempo de preenchimento capilar, avaliação de mucosas, presença de lesões e fraturas, condição do pelo, condição dentária). Todos os procedimentos de campo e laboratoriais foram realizados de acordo com licenças concedidas pelo Sistema de Informação e Autorização de Biodiversidade do Instituto Chico Mendes para Conservação da Biodiversidade (ICMBio – 49662-5) e pelo Comitê de Ética para Uso Animal da Universidade Católica Dom Bosco, Campo Grande, MS (CEUA – 19/2015).

Para o diagnóstico parasitológico de T. evansi, foi realizada a técnica do micro-hematócrito (MHCT), descrita por Woo⁽³⁰⁾. Para o diagnóstico parasitológico de T.cruzi, foi realizado o hemocultivo (HC) de cerca de 200-400μl de sangue total em meio de cultura bifásico NNN (Neal, Novy, Nicolle) LIT (triptose de infusão de fígado), mais 10% de soro bovino fetal. As semeaduras foram feitas em duplicata e as culturas incubadas a 27°C por 30 dias, sendo monitoradas uma vez por semana.
Para a detecção de IgGs anti-T. evansi e anti-T.cruzi, foram realizadas a reação de imunofluorescência indireta (RIFI) e o ensaio imunoabsorvente enzimático (ELISA, Biomanguinhos, Rio de Janeiro-RJ, Brasil), segundo Rocha et al.⁽¹⁵⁾ e Alves et al.⁽³¹⁾, respectivamente.

O DNA genômico foi extraído a partir de 200 μl de sangue total de cada amostra, utilizando-se o QIAamp Blood DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante. O DNA total foi diluído com 50 μl de tampão de eluição e armazenado a -20°C até a realização dos testes moleculares.

A fim de se detectar o DNA dos protozoários T. evansi e T. cruzi nas amostras sanguíneas dos lobinhos, foi realizada a reação em cadeia da polimerase (PCR), dividida em duas etapas. Inicialmente, todas as 48 amostras foram submetidas à PCR, utilizando-se como alvo uma região variável do gene do 18S rRNA da família Trypanosomatidae, de acordo com Smith et al.⁽³²⁾. A partir das amostras positivas, foram realizadas PCRs, utilizando-se como alvos os genes 24Sα rRNA (específico para T.cruzi) e uma sequência do DNA satélite (específico para T. evansi), de acordo com Souto e Zingales⁽³³⁾ e Masiga et al.⁽³⁴⁾, respectivamente. Os primers utilizados estão dispostos na Tabela 1.

Foram determinadas as contagens de eritrócitos e de leucócitos, o volume globular (VG) e o volume corpuscular médio (VCM). As contagens de hemácias e leucócitos foram realizadas em Câmara de Neubauer, enquanto a análise do volume globular foi realizada em microcentrífuga para capilares. O VCM foi calculado dividindo-se o VG pelo número de eritrócitos (apenas a unidade da potência de 10⁶) e multiplicando-se por 10.

No presente estudo, um animal foi considerado infectado quando positivo em no mínimo um dos testes diagnósticos utilizados: parasitológico, sorológico e molecular. Foi aplicada uma estatística descritiva (média ± DP) para obtenção dos parâmetros médios hematológicos. O teste de Shapiro-Wilk foi aplicado aos dados para verificar a distribuição normal. Finalmente, o teste Kruskal-Wallis (KW) foi aplicado para determinar se houve diferença nos valores hematológicos (variável dependente), entre os diferentes grupos de infecção, estações e sexo (variáveis independentes). O Post hoc Mann-Whitney (MW) teste foi utilizado para avaliar resultados pareados do teste de Kruskal-Wallis. As variáveis foram consideradas estatisticamente significativas quando os valores de p foram ≤0.05. Todas as análises foram realizadas no programa R⁽³⁵⁾.

Resultados

Dos 48 lobinhos coletados (22 fêmeas e 26 machos), sete apresentaram infecção somente para T. evansi, sete somente para T. cruzi e nove coinfectados. Nos testes sorológicos, quatro (8%) lobinhos foram positivos para T. evansi, 13 (27%) para T. cruzi, e três (6%) mostraram-se coinfectados. Em relação ao teste molecular, 10 (21%) animais apresentaram positividade para T. evansi, sendo um indivíduo positivo na PCR e na sorologia para T. evansi. Além disso, seis lobinhos positivos na PCR para T. evansi apresentaram IgGs anti-T. cruzi, sendo estes considerados coinfectados (Tabela 2). Não houve positividade em nenhum dos testes parasitológicos (MHCT e HC).

Com relação às análises hematológicas, a média da contagem de hemácias foi de 3.1 ± 0.9 (x10⁶/mm³), a média da contagem global de leucócitos foi de 12.6 ± 5.1 (x103/mm³), a média do volume globular de 40,3 ± 8,6 (%) e uma média de VCM de 142 ± 52.8 (FL). Nenhuma diferença estatística foi encontrada nos valores médios de hemácias (x10⁶/mm³) - (χ2 = 0.3187, df = 03, p > 0.05), VG (%) - (χ2 = 2.552, df = 03, p > 0.05) e VCM (FL) - (χ2 = 0.5056, df = 03, p > 0.05) entre lobinhos infectados e não infectados. Entretanto, nossos dados indicam uma leve diminuição desses valores em animais infectados por T. evansi (Tabela 3), embora, segundo os valores médios de referência publicados, não caracterizem anemia⁽³⁶⁾ ou apenas anemia discreta⁽³⁷⁾ . Além disso, foi observado um aumento significativo nos valores médios de leucócitos (χ²=6.036, df = 03, p < 0.05) em animais infectados por T. cruzi (Tabela 3).

Quando categorizamos os animais de acordo com o sexo, observamos que as fêmeas apresentaram valores hematológicos ligeiramente acima dos valores encontrados para machos, porém sem significância (p > 0,05) (Tabela 4). Em relação ao período de captura, os animais capturados no período de cheia apresentaram diferença significativa nos valores de hemácias (menores) e VCM (maior) quando comparado ao período de seca (p < 0,05) (Tabela 4).

Nossos resultados indicam que os lobinhos no Pantanal têm contato com T. cruzi e desenvolvem anticorpos, uma vez que foi encontrada apenas positividade no teste sorológico. De fato, as infecções por T. cruzi se caracterizam por curtos períodos iniciais de parasitemias (30 a 40 dias pós-infecção), seguidos pela evasão dos parasitas da circulação^(21,38). Por outro lado, a parasitemia patente, expressa pela positividade na PCR observada nos lobinhos parasitados por T. evansi, é esperada devido ao curso da infecção por T. evansi se caracterizar por períodos sucessivos de remissão de parasitemia, além da variação antigênica do parasita durante o curso da infecção^(39,40). Porém, como não foram registrados sinais clínicos fisiopatogênicos, não se podem caracterizar esses animais como doentes ou não.

Embora nossos resultados não mostrem diferença significativa para as contagens de hemácias, VG e VCM na infecção por T. evansi em lobinhos no Pantanal, diferentes graus de anemia ocasionada por infecção de T. evansi vêm sendo registrados em várias espécies de mamíferos na região^(23,41-45). Assim como cães domésticos experimentalmente e naturalmente infectados com T. evansi apresentaram anemia, caquexia e o óbito^{(46, 47)}. Porém, nenhum dos resultados dos lobinhos capturados neste estudo caracterizou anemia, moderada ou acentuada. Embora os cálculos indiquem macrocitose, esta deveria ter sido confirmada nas análises microscópicas, como descrito por Weiss e Wardrop⁽⁴⁸⁾.

As análises estatísticas mostraram que os menores valores de hemácias e os maiores valores de VCM nos lobinhos estão diretamente associados ao período da cheia. No entanto, a falta da análise microscópica dos esfregaços sanguíneos não permitiu essa confirmação, principalmente na ausência do valor do Conteúdo de Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM), imprescindível na correlação microscópia, para definir a morfologia eritrocitária. Principalmente nesse caso, em que a macrocitose calculada é muito superior aos valores de referências publicados^(49,36,37) e poderiam caracterizar intensa regeneração eritrocitária, ainda que os menores valores eritrocitários indicassem apenas anemia discreta, segundo os valores de referência⁽³¹⁾.

Apesar de não termos observado influência do sexo nos índices hematológicos avaliados, outros estudos relacionados a diferenças hematológicas entre machos e fêmeas de lobinhos foram reportados, mostrando que os valores de hemácias para as fêmeas são ligeiramente maiores, igualmente ao encontrado no presente estudo. De fato, Silva et al.⁽⁴⁹⁾ encontraram, no Pantanal, valores de hemácias para fêmeas e machos de 3,6 e 2,8 (x10⁶/mm³), respectivamente, bem como Mattoso et al.⁽³⁶⁾, em lobinhos cativos, 4,4 (x10⁶/mm³) para fêmeas e 4,3 (x10⁶/mm³) para os machos. Esses números mostram que animais que habitam a natureza apresentam valores médios de hemácias bem menores que aqueles reportados como referência para cães domésticos⁽⁵⁰⁾ e lobinhos cativos⁽³⁶⁾ ou encontraram-se anêmicos e os valores elevados de VCM podem indicar regeneração eritropoiética ou não, mas não foram confirmados pela ausência dos esfregaços sanguíneos.

Além disso, a influência observada no aumento de leucócitos dos lobinhos infectados por T. cruzi e coinfectados, comparados aos não infectados, se assemelha a relatos em cães infectados pelo T. cruzi⁽²²⁾. Os maiores valores médios da leucometria global nesses animais, quando comparados aos não infectados ou positivos apenas para T. evansi, podem ser consequência da imunossupressão transitória observada durante esses períodos^(51,52). De fato, o aumento de leucócitos durante a infecção pelo T. cruzi em mamíferos silvestres vem sendo reportado em condições experimentais e naturais em Thrychomis pachyurus e quatis, respectivamente^(53,54).

Embora seja esperado que o parasitismo resulte em uma situação desfavorável ao hospedeiro parasitado, nem sempre isso acontece. De fato, as relações simbióticas não são estáticas, mas dinâmicas no tempo e no espaço^(55,56). Dependendo de fatores inerentes ao parasita (quantidade de inoculo, diferentes cepas com diferentes graus de virulência e/ou patogenicidade e coinfecções), ao hospedeiro (idade, sexo, estado nutricional/imunológico, condição reprodutiva e raça) e ao meio (escassez de alimentos, condições climáticas severas, fragmentação/diminuição do hábitat original e aquecimento global), o parasitismo pode não resultar em um dano às condições orgânicas e de homeostase de indivíduos⁽⁵⁷⁾.

Conclusão

O sexo e a infecção por T. evansi não influenciaram nos dados hematológicos de lobinhos do Pantanal. Contudo, observamos que os lobinhos soropositivos para infecção por T. cruzi apresentaram valores maiores na contagem global de leucócitos quando comparados aos não infectados ou positivos apenas para T. evansi. Adicionalmente, observamos que os lobinhos na estação da cheia apresentaram contagem de hemácias menores e VCM elevado, quando comparados com a estação da seca, além de uma macrocitose não confirmada morfologicamente.

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