Introdução

Considerando as necessidades dos microrganismos, manuseio e armazenamento nos laboratórios, a manutenção de estirpes pode ocorrer em curtos períodos (dias ou meses), nos quais as culturas bacterianas podem ser mantidas a temperaturas relativamente baixas (4-10°C). Contudo, a conservação prolongada se apresenta como opção mais viável, porém, para isso, deve-se optar pelo armazenamento em temperaturas ultrabaixas como a criopreservação em freezers a -80°C, em nitrogênio líquido a -196°C ou a utilização do processo de liofilização que consiste no congelamento e desidratação das células bacterianas⁽¹⁾.
A liofilização é um dos processos mais conhecidos e empregados atualmente para a conservação de microrganismos. Para que este processo seja bem-sucedido, é necessário que os crioprotetores protejam a célula bacteriana, a fim de que, quando o liófilo for reidratado para uso, o microrganismo apresente as mesmas características fenotípicas e genotípicas que uma cultura de trabalho⁽²⁾.
Crioprotetores são substâncias adicionadas aos meios de suspensão de microrganismos que conferem uma ação protetora á células, evitando efeitos drásticos das etapas de preservação. Os crioprotetores reduzem danos durante o congelamento, descongelamento e secagem⁽²⁾.
A literatura cita o uso de diversos crioprotetores para o processo de liofilização. No entanto, poucos estudos apresentam uma comparação entre eles, e tampouco determinam uma "vida-útil" da cultura liofilizada.
Para provedores de ensaio de proficiência e produtores de material de referência é um grande desafio a estabilização de culturas liofilizadas a longo prazo, tendo em vista que microrganismos tem seu próprio ciclo de vida.
A glicose (monossacarídeo) e a trealose (dissacarídeo), são considerados alguns dos melhores crioprotetores da atualidade. Já a quitosana é um polissacarídeo que pode ser utilizado com esta ação⁽³⁾.
A Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae apresentam grande importância para ensaios de proficiência de microbiológicos. O microrganismo Saccharomyces cerevisiae é considerada uma levedura importante para a indústria alimentícia, amplamente utilizada na produção de pães, laticínios, cervejas, vinhos e cachaças, sendo necessárias cepas estáveis em longos períodos.
Objetivou-se com o presente estudo avaliar o desempenho dos crioprotetores de glicose, trealose e quitosana na manutenção da viabilidade de culturas de microrganismos de importância na indústria de alimentos, Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae.

Material e método

O presente estudo foi realizado no laboratório de microbiologia do SENAI em Chapecó. Para este estudo, utilizou-se cepa de Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763, 2° passagem, lote 699-75 e cepa de Escherichia coli ATCC 25922, 2° passagem, lote 35-158. O meio de cultura base utilizado para a liofilização foi o ágar Skim Milk (Difco®). Os crioprotetores utilizados foram: glicose anidra (Vetec®), Trealose (Merk®) e quitosana de baixo peso molecular (Sigma-Aldrich®).
A porcentagem ideal de crioprotetores extracelulares para cepas bacterianas e fúngicas é de aproximadamente 10%⁽⁴⁾, por isso utilizou-se essa porcentagem para todos os crioprotetores testados.
Para cada microrganismo, foram realizados quatro tratamentos, ou seja, quatro formas diferentes de preparo da cepa: T1: Meio Skim Milk sem adição de crioprotetores; T2: Meio Skim Milk com adição de 10% de glicose; T3: Meio Skim Milk com adição de 10% de trealose; e T4: meio Skim Milk com adição de 10% de quitosana.
Para a preparação dos microrganismos, adicionou-se 1mL da cepa em fase estacionária ao meio de cultivo esterilizado – Skim Milk com e sem adição de crioprotetores – e procedeu-se a incubação. As amostras com Saccharomyces cerevisae foram incubadas por 25 °C durante 5 dias. As cepas de E. coli foram incubadas à temperatura de 35 °C durante 24 horas.
Após a incubação, dispensou-se 2mL de cada cultura em um frasco ampola de vidro para liofilização e, imediatamente congelou-se em ultrafreezer à temperatura de -70°C, o que caracteriza um congelamento rápido. Utilizou-se esta forma de congelamento, pois diminui a formação de cristais de gelo no interior da célula. O processo de liofilização foi realizado com o liofilizador da Thermo Electron Corporation Modelo FLR-DRYING.
As quantificações foram realizadas em cinco datas de quantificação distintas. A primeira foi realizada após a incubação do meio e antes do ultracongelamento, a segunda quantificação foi realizada após o ultracongelamento, antes de ser liofilizado, a terceira foi 24 horas após o término da liofilização, a quarta 30 dias após a liofilização e a quinta quantificação foi realizada 60 dias após a liofilização. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. Para a terceira, quarta e quinta quantificação, os liófilos foram mantidos à temperatura ambiente protegidos da luz.
Para a quantificação de Saccharomyces cerevisiae, utilizou-se Placas Petrifilm YM (®3M, lote 2017- 01 KD) e foi realizado método de Contagem de Bolores e Leveduras, de acordo com a metodologia AOAC Official Method 997.02. Para a quantificação de E. coli, utilizaram-se Placas Petrifilm EC (3M®, lote 2017-03 KC), e foi realizado método de Contagem de E. coli, conforme metodologia AOAC Official Method 998.08.
Além da viabilidade da utilização dos crioprotetores, foram avaliadas as características fenotípicas e bioquímicas das colônias presentes, a fim de verificar as injúrias provocadas às bactérias.
Os dados obtidos foram submetidos a análise de variância pela ANOVA, e, quando significativas, a comparação de médias pelo Teste de Tukey (p<0,05) e análise de regressão para os diferentes momentos de quantificação (p<0,05). Para as análises estatísticas, utilizou-se o Software Bioestat, versão 5.3.

Resultados e discussão

O preparo e a utilização do meio de cultivo Skim Milk seguiram a orientação fornecida pelo seu fabricante, no entanto, os liófilos obtidos apresentaram-se quebradiços, com aparência opaca e cristalizada. A possível causa dessa reação é a cristalização dos açúcares presentes. Desse modo, acredita-se ser necessário a avaliação de novas formas de esterilização ou uma nova combinação do binômio tempo x temperatura.
Após liofilizada, as cepas foram armazenadas em temperatura ambiente, em local livre de umidade durante 60 dias.
Para os dois, o crescimento deu-se conforme o esperado, sem alterações nas características de crescimento. A Tabela 1 apresenta os resultados da viabilidade da E. coli.

Conforme Tabela 1, pode-se observar que a adição da trealose (T3) favoreceu uma recuperação maior da E. coli após a etapa do ultracongelamento. Nesta etapa, o T3 diferiu significativamente dos demais tratamentos, pois obteve-se uma contagem maior de microrganismos, o que comprova a eficácia da trealose como crioprotetor.
Esse resultado comprova dados encontrados na literatura que afirmam de que crioprotetores são geralmente utilizados na intenção de prolongar a viabilidade celular após o congelamento e a liofilização, mas não para analisar a estabilização da concentração microbiana ao longo do tempo de estoque dos microrganismos liofilizados⁽⁵⁾.
O acúmulo da trealose no interior da célula promove uma proteção da estrutura terciária das proteínas, através da formação de pontes de hidrogênio, protegendo-as da desnaturação durante o processo de dessecação. Além disso, a trealose na superfície da célula também protege a face externa da membrana citoplasmática⁽⁶⁾.
De maneira geral, açúcares não são capazes de se difundir da membrana plasmática, pois atuam criando uma pressão osmótica que induzem a desidratação celular, portanto agem como agentes osmóticos externos, removendo o excesso de água intracelular através de um gradiente osmótico e conduzindo a uma baixa incidência de formação de cristais de gelo dentro da célula. Também elevam a sobrevivência de espécies no processo de criopreservação, pois podem exercer a função de solutos, reduzindo o ponto de congelamento e minimizando a formação de gelo extracelular^(6,7).
Ao realizar a avaliação dos tempos de contagem 4 e 5 (30 e 60 dias após a liofilização, respectivamente), o tratamento que conservou melhor e, portanto, permitiu uma melhor recuperação da E. coli foi o T4, ou seja, um polissacarídeo.
Os microrganismos que são naturalmente capazes de sobreviver à desidratação acumulam açúcares intracelularmente, principalmente dissacarídeos como a trealose e a sacarose. Essas moléculas de açúcares podem substituir moléculas de água intracelulares que hidratam proteínas e membranas, prevenindo a desnaturação de proteínas e a transição da fase liotrópica dos lipídeos das membranas⁽⁸⁾. No entanto, de acordo com os dados obtidos neste trabalho, após um longo período de armazenamento, a adição dos criopreservadores glicose e trealose não tiveram efeito benéfico na recuperação da E. coli, chegando inclusive a obtermos valores maiores de recuperação em T1, sem adição de criopreservadores. Mesmo com a adição dos criopreservantes, houve a perda de até 4 logs na contagem de microrganismos no intervalo entre a criopreservação e 60 dias após a liofilização, para todos os tratamentos. Esse efeito pode ser melhor observado analisando a Figura 1.

Conforme resultados das análises de regressão linear, houve relação significativa (p<0,05) em todos os tratamentos, demonstrando que há um decréscimo na contagem de microrganismos (log₁₀) conforme a evolução do tempo. No tratamento em que não houve a adição de crioprotetores (T1) foi possível observar uma queda brusca no resultado da contagem (T1) logo após a liofilização (entre os tempos 2 e 3). Nos demais tratamentos, com adição dos diferentes crioprotetores, o decréscimo foi mais homogêneo entre todas as faixas de tempo.
Em estudo semelhante realizado, houve uma perda de 9,2% da concentração de células do tratamento que utilizou Trealose em relação ao tratamento sem adição de crioprotetor.
A Tabela 2 demostra que, nas duas primeiras quantificações (antes e depois do ultracongelamento), T1, T2 e T3 são estatisticamente iguais, com a contagem em T4 sendo um pouco maior. Após o ultracongelamento (Data de quantificação 2), T4 mantém-se pouco mais elevado, provavelmente devido à contagem inicial deste tratamento também ter sido maior.

Após o ultracongelamento (Data de quantificação 3), os tratamentos T3 e T4 diferem dos tratamentos T1 e T2, que possuem uma recuperação maior do microrganismo Saccharomyces cerevisiae, o que demostra um efeito crioprotetor menor dos criopreservantes trealose e Quitosana.
Com o passar do tempo, após 30 e 60 dias de liofilização, não houve diferença estatística entre os tratamentos para o microrganismo testado.
Mesmo com a constatação de que, quando houve diferença entre os tratamentos, esta foi pequena, pode-se observar que a perda de viabilidade do S. cerevisiae foi menor do que da E. coli, sendo de apenas 2 logs. A Figura 2 evidencia a evolução da recuperação do S. cerevisiae em relação aos períodos de quantificação.

Conforme análise estatística de regressão com ajustamento de curvas, nos três tratamentos em que houve adição de crioprotetores (T2, T3 e T4) também houve uma relação significativa entre os resultados da contagem (log₁₀) e a evolução do tempo (p<0,05). No tratamento em que não houve adição de crioprotetores (T1), essa relação não foi significativa (p>0,05).
As variações da resistência microbiana à dessecação estão relacionadas à fase de tratamento em que não houve adição de crioprotetores (T1). Devido à escassez de fontes de carbono e à exaustão de nutrientes na fase estacionária, diversas respostas fisiológicas são induzidas, fazendo que a célula bacteriana tente resistir a essa insuficiência de nutrientes. Tais respostas de sobrevivência acabam também protegendo a célula de outras condições adversas, como a dessecação e as baixas temperaturas⁽⁶⁾.
Estudos demonstraram que os açúcares no geral, principalmente dissacarídeos, aumentam a tolerância à dessecação em diferentes microrganismos devido à estabilização de membranas e proteínas^(6-33).
No presente estudo, essa relação não ficou bem evidenciada, talvez pelas concentrações utilizadas, ou, também, pela escolha do agente crioprotetor.
Segundo estudo realizado comparando como crioprotetores glicerol, sacarose e gelatina na manutenção da viabilidade de Keffir, a sacarose demonstrou diferença significativa quando comparada à amostra controle (amostra em que não havia agente crioprotetor), ou seja, a sacarose (dissacarídeos) apresentou bom desempenho como agente crioprotetor em leveduras⁽³³⁾.
Outro estudo realizado avaliando trealose como agente crioprotetor em leveduras para a produção de pães demonstrou que este dissacarídeo foi efetivo na conservação da viabilidade celular quando comparada à amostra controle⁽³⁴⁾.
No entanto, com os resultados obtidos neste estudo, não se pôde inferir o mesmo que os estudos supracitados. Para a levedura, não houve diferença significativa na manutenção da viabilidade inserindo agentes crioprotetores. Precisa-se de mais estudos aprofundados nesse sentido.

Conclusão

Nenhum dos tratamentos estudados foi efetivo na conservação da viabilidade em longo prazo, visto que houve uma diminuição de 4 log₁₀/UFC/ml da primeira à última quantificação (60 dias após a liofilização), ou seja, cerca de 50% da contagem inicial foi perdida nesse período.
Para Saccharomyces cerevisiae, pode-se concluir que não houve ganho de viabilidade com a adição de trealose e quitosana como crioprotetores, porém esses crioprotetores demonstraram-se mais eficientes na viabilidade de Saccharomyces cerevisiae (diminuição de 2 logs) do que de Escherichia coli (diminuição de 4 logs).
Sugere-se que sejam testados novos agentes crioprotetores e novas concentrações a fim de aumentar a viabilidade e a proteção de cepas liofilizadas utilizadas em laboratório.