DOI: 10.5216/cab.v11i1.4521

ANÁLISE DA PRODUÇÃO DE EMBRIÕES NA FERTILIZAÇÃO IN VITRO E TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES PARA DOADORAS NELORE

Renato Travassos Beltrame,¹ Celia Raquel Quirino,² Luis Gustavo Barioni,³
Ângelo José Burla Dias⁴ e Paulo Marcelo de Souza⁵

1. Doutorando em Ciência Animal, LRMGA, CCTA, UENF. E-mail: rtbeltrame@terra.com.br
2. Professor associado da Universidade Estadual do Norte Fluminense
3. Pesquisador doutor da Embrapa Cerrados
4. Professor associado da Universidade Estadual do Norte Fluminense
5. Professor associado da Universidade Estadual do Norte Fluminense.

RESUMO

Ajustou-se uma função de densidade probabilidade para o número de embriões viáveis produzidos após fertilização in vitro em doadoras da raça Nelore, a partir de dados fornecidos pela Associação Brasileira de Criadores de Zebu (ABCZ), referente à análise de 20.619 doadoras, 71.602 aspirações e um total de 509.643 embriões. Modelou-se a densidade probabilidade do número de embriões viáveis mediante a função exponencial, executando-se a determinação dos parâmetros por meio da máxima verossimilhança, em um método de gradiente não linear. O nível de precisão obtido foi de RMSE = 0,040 e R₂ = 0,98, para a representação da probabilidade do número de embriões viáveis produzidos por doadoras Nelore na técnica de fertilização in vitro(FIV). Para comparar os modelos (curvas de probabilidade de transferência de embriões ajustada por Beltrame,em 2006, e de FIV, neste trabalho), aplicou-se a técnica de comparação de curvas com o teste F (Silva e Azevedo, 2002). Não foram encontradas diferenças entre as curvas do número de embriões viáveis obtidos após coleta e produzidos após aspiração de doadoras na raça Nelore. Ainda, sugere-se a existência de um fator único limitante que afete biologicamente a produção de embriões nas técnicas de transferência de embriões e fertilização in vitro.

ABSTRACT

INTRODUÇÃO

Na bovinocultura nacional, diversos avanços têm sido demonstrados na fertilização in vitro (FIV), transferência de embriões (TE) e sexagem de espermatozoide. Entretanto, a incerteza dos resultados é permanente, o que gera imprecisões nas respostas simuladas, quando comparadas aos resultados observados. Essas distinções têm sido minimizadas quando metodologias corretas de simulação são implementadas (BELTRAME, 2006; BELTRAME, 2007; BARIONI, 2007).
Durante o processo de FIV de embriões de uma doadora qualquer, é impossível prever com exatidão o número de oócitos que serão aspirados nem o número de embriões viáveis a serem produzidos. Inúmeras decisões pertinentes à FIV e à TE são dependentes dessa informação (número de receptoras a sincronizar, custo, número de embriões a congelar, material utilizado, tempo etc.). Mesmo assim, em algumas biotécnicas da reprodução animal, é necessário fazer previsões a respeito do valor futuro de certas variáveis, tomando por base dados históricos (BELTRAME et al., 2007). Fica evidente, portanto, a necessidade de um estudo mais apurado do comportamento de uma série de variáveis aleatórias, objetivando determinar seu comportamento em cenários simulados e não sua utilização como variáveis deterministas.
Uma vez definida uma variável aleatória, existe interesse no cálculo dos valores das probabilidades associadas a essa variável. O conjunto das variáveis e das probabilidades correspondentes é denominado distribuição de probabilidades, isto é: {(xi,p(xi), I=1,2,…n}. Neste caso, a função de densidade de probabilidade é a função que associa a cada valor assumido pela variável aleatória a probabilidade do evento correspondente, tal como: P(X=xi)= P(Ai), i=1,2,…,n ( FREITAS FILHO, 2001; LEVINE et al., 2005).
A simulação de sistemas requer o uso de sequên­cias de valores de determinadas variáveis aleatórias. Podem ser considerados três modos de obtê-las: o uso de sequências provenientes de observações efetuadas previamente; sequências geradas aleatoriamente a partir de distribuições empíricas construídas com observações efetuadas previamente; sequências geradas aleatoriamente a partir de distribuições clássicas, cujos parâmetros foram estimados de acordo com observações efetuadas previamente (PERIN FILHO, 1995).
No primeiro caso, exige-se um processo demorado, que requer bastante memória e que, portanto, é inadequado para a aplicação em simulação de sistemas. As outras duas alternativas são dependentes de um gerador de números aleatórios, que permite obter valores de variáveis aleatórias com as distribuições desejadas.
A determinação da curva de densidade probabilidade da variável número de embriões viáveis objetiva sua projeção de forma realista em estudos de simulação. Assim, estimativas do número de prenhezes, número de receptoras e doadoras a se utilizar, custo da técnica, elaboração de projetos e cálculos de viabilidade financeira podem ser realizados com maior precisão, minimizando risco (BELTRAME 2006).
Neste contexto, o objetivo deste trabalho é determinar a curva de densidade probabilidade do número de embriões viáveis produzidos por FIV para doadoras da raça Nelore, efetuando sua comparação com a curva de densidade probabilidade da TE, determinada por BELTRAME (2006).

MATERIAIS E MÉTODOS

O presente trabalho toma por base dados concedidos pela Associação Brasileira de Criadores de Zebu (ABCZ) relativo à FIV em doadoras da raça Nelore. Ainda, a frequência do número de embriões viáveis obtidos após TE e descrita por BELTRAME (2006) foi utilizada neste trabalho.
Por intermédio da ABCZ, uma base de dados compondo arquivos eletrônicos em formato “txt”, com dados de embriões FIV, foram recebidos contendo, na linha, o evento, e nas colunas a seguinte padronização: código da doadora; código do touro; uf da fazenda; data da aspiração; data da transferência; embriões produzidos; embriões transferidos; embriões perdidos.
Organizaram-se a informações relativas à FIV em planilhas do Microsoft Excel 2003, e a partir desse ponto, procedeu-se a sua análise por meio da ferramenta SAS for Windows 1999. Dados de 73.121 aspirações foram disponibilizados.
Uma vez na ferramenta SAS, eliminaram-se da análise todos os dados incoerentes ou de valor nulo. Consideraram-se apenas as aspirações realizadas entre os anos de 2000 a 2007.
Foram retiradas da análise as aspirações em que o número de embriões obtidos e/ou perdidos era superior a 35, apresentavam datas inconsistentes e/ ou valores em branco.
A aplicação da restrição resultou na eliminação de 1.519 aspirações. A análise partiu, então, de dados referentes a 20.619 doadoras, 71.602 aspirações e 509.643 embriões.
A seleção dos dados relevantes foi realizada através da função ‘proc freq” do SAS for Windows 1999. No caso específico, essa função retornou o somatório do número observado de aspirações para cada valor de número de embriões viáveis gerados. O número total de aspirações que obtiveram embrião viável nulo, até o somatório de aspirações que obtiveram 35 embriões viáveis, número máximo de embriões viáveis por doadora restringido no banco, foi gerado a partir desse “comando”.
Uma comparação gráfica e uma análise numérica baseada na frequência observada e estimada a partir do modelo de distribuição (ou distribuições) selecionada foram realizadas.  Definiu-se por estimar a frequência nula como sendo similar à frequência de obtenção de um embrião viável e a partir daí realizar seu ajuste.
O comportamento gráfico dos dados observados torna-se fundamental para um diagnóstico preliminar da escolha de uma distribuição, conforme é demonstrado na Figura 1.
A disposição gráfica das diversas distribuições existentes e o comportamento dos dados observados sugerem uma aproximação à distribuição exponencial negativa [ EX(λ) ] (BENJAMIN & CORNELL, 1970). Sendo assim, uma metodologia numérica foi utilizada, no intuito de identificar o melhor valor dos parâmetros e comparar o ajuste desses modelos aos dados observados.
Procedeu-se à estimação dos parâmetros da distribuição e seu ajuste, para representar com eficiência a variância e minimizar o erro total, através do método da “máxima verossimilhança” e de seu estimador (KOSTINA, 2004). O método GRG2 como instrumento de otimização foi aplicado usando-se Microsoft Excel 2003® Solver.
Os procedimentos de ajuste descritos foram resumidos e podem ser observados na Tabela 1, para o uso de uma distribuição exponencial [ EX(λ) ].
Estatisticamente, após a parametrização do modelo, procedeu-se ao teste F e calculou-se o coeficiente de determinação. Assim, foram determinados o quanto da variância obtida na parametrização era explicada pelo modelo e a significância dos dados obtidos pela nova distribuição.
Como critérios de escolha da melhor função de distribuição que se ajusta aos dados observados, foram avaliados, em fator de importância, respectivamente, a soma do quadrado do erro (SQerro) e o erro de predição.

A frequência observada corresponde à demonstração do evento específico no passado. Os dados obtidos representam o somatório do número de coletas com embriões viáveis, variando de 0 a 35. Tais informações possibilitaram a determinação da curva de densidade probabilidade. A Tabela 2 apresenta estes dados.
Como observado na Tabela 2, a frequência de embriões nulos apresenta-se como um dado atípico na tabela (f(0)=0,63). Embora passível de ocorrência, sugere-se que tal dado seja proveniente da falha de comunicação por veterinários e fazendeiros das aspirações que apresentam número de embriões viáveis nulos, apresentando, portanto, frequência extremamente baixa.
No processo de análise dos dados coletados para uso em um simulador em análises estocásticas, uma das principais ações é a identificação de uma distribuição teórica de probabilidades que represente, da melhor maneira possível, o comportamento da variável (FREITAS FILHO, 2001).
Para FIV, a média de embriões viáveis por aspiração revelados pela frequência observada foi de 6,43 + 5,5. A obtenção dessa média teve como pressuposto que o número de aspirações que resultaram em zero e um embriões foi similar. O parâmetro de ajuste do modelo para FIV foi k= 0,148 para a distribuição exponencial negativa. Considerou-se o ajuste altamente significativo  (P<0,0001; Tabela 3 e Figura 2).
O coeficiente de determinação também pode ser considerado alto (R2 = 0,98), indicando que a distribuição explica a maior parte da variância nos dados observados. O erro-padrão da regressão foi de  0,040.
Tenta-se predizer a eficiência dos programas de FIV por medida em relação ao número de blastocistos obtidos a partir do número de ovócitos postos em cultivo e fertilizados com um sêmen determinado (FUENTES, 2006). Entretanto, o comportamento dessas variáveis não é conhecido na técnica de FIV.
A média de embriões viáveis obtidos por aspiração neste trabalho encontra-se próxima à relatada na literatura. NONATO JR. et al. (2006) compararam quatro protocolos de OPU em vacas Nelore. O número de embriões produzidos variou de 6,1 + 1,0 a 12,0 + 2,6, este último com utilização de progestágeno.
O grupo de MACHADO et al. (2006), intencionando estudar a variabilidade na produção in vitro, analisou a hipótese de que uma menor variabilidade ocorreria entre gêmeos idênticos do que quando indivíduos não relacionados eram trabalhados. Diferença (P< 0,05) foi encontrada no número de blastocistos produzidos entre os grupos comparados.
CHAUBAL et al. (2007) compararam tratamentos hormonais na tentativa de promover estimulação ovárica e aumentar a produção de embriões na técnica de FIV. Embora um número menor de embriões tenha sido produzido diante dos tratamentos utilizados, a variabilidade na produção de embriões persistiu.
Fica clara a importância do conhecimento do comportamento da variável e suas projeções dentro de sistemas de simulação. Através da Figura 2, demonstra-se que existe um comportamento característico da variável analisada independente do sistema em estudo. Este comportamento é decrescente e proporcional ao aumento no número de embriões produzidos, sendo ajustável a situações específicas. Ainda, os resultados deste trabalho indicam que o número de embriões viáveis produzidos por aspiração de doadoras da raça Nelore pode ser estimado por meio da distribuição exponencial.

Comparação de modelos

A Figura 3 e os resultados obtidos decorrentes da avaliação de comparação dos modelos indicam a não significância da hipótese testada, ou seja, não existe diferença (P>0,05) entre as curvas de TE e FIV analisadas. A demonstração estatística do resultado pode ser observada na Tabela 4.
É importante destacar que estudo como este é incipiente na esfera da reprodução animal. Embora matematicamente se chegue a um resultado pontual, a explicação biológica de similaridade de curvas engloba uma série de suposições.
Pelos resultados apresentados, inicialmente, supõe-se que exista um processo em comum que limite o número de embriões viáveis nas duas técnicas. Esta ideia pode ser consequência de fatores que influenciam a dinâmica folicular na resposta ovulatória de doadoras, fatores que afetam a fertilização e a viabilidade embrionária, e ainda fatores relacionados ao programa de manejo animal, como descrevem PEIXOTO et al. (2002). 
Tendo-se a dinâmica folicular como fator limitante na produção de embriões, a elaboração de modelos matemáticos que retratassem a evolução do crescimento folicular de forma individual, excluindo-se o comportamento da população, poderia ser útil para estimar de forma mais precisa o número de embriões viáveis obtidos por coleta. Entretanto, estudos visando tal modelagem são complexos e ainda não foram descritos na medicina veterinária.
Em relação à similaridade das curvas, um dos pontos que se cogita é que, diante da projeção do número de embriões viáveis na TE ou na FIV, o número de embriões gerados através de processo aleatório possuirá o mesma capacidade de evolução. Neste caso, a dinâmica temporal deve ser alterada. A aceleração do melhoramento genético animal fica evidenciada pelo tempo (repetição) e não pela técnica utilizada. Em situações similares em que os efeitos genético e ambiental não forem considerados, a produção embrionária projetada em um modelo de simulação pode ser a mesma. 
Ainda quanto à comparação FIV e TE, os resultados permitem identificar as biotécnicas como auxiliares e não como conflitantes. Neste caso, ineficiências de uma biotécnica podem ser cobertas pelos benefícios da outra. Animais que não respondem à TE podem ser utilizados na FIV. Da mesma forma, animais com consecutivas TEs podem ser inseminados e ao início da gestação serem submetidos à FIV. Com isso, uma maior  velocidade de seleção pode ser obtida. Destaca-se que outros bancos de dados devem ser testados no intuito de confirmar os resultados obtidos neste estudo.
Ressalta-se que uma maior atenção deve ser destinada aos índices das biotécnicas. Embora não tenham sido demonstradas diferenças nas curvas de produção de embriões entre TE e FIV, algumas variá­veis como taxas de gestação, utilização de doadoras consecutivamente e possibilidade de congelamento de embriões podem ser decisivas na escolha por uma das biotécnicas de forma específica.

CONCLUSÕES


AGRADECIMENTOS


REFERÊNCIAS