MEDICINA VETERINÁRIA

 

 

 

 

 

 

SEPTICEMIA EM GIRINOS DE CRIAÇÃO NA FASE PRÉ-METAMÓRFICA

 

 

RESUMO

 
SEPTICEMIA IN PRE-METAMORPHIC FARMED TADPOLES

ABSTRACT

 

INTRODUÇÃO

 A ranicultura é uma atividade em expansão na América do Sul, sendo a rã-touro Americana (Rana [Lithobates] catesbeiana Shaw, 1802) a espécie cultivada, introduzida no Brasil em 1935, mas as populações atualmente criadas foram originadas de 300 casais importados da América do Norte em 1970 (MATHIAS & SCOTT, 2004). Em decorrência do clima favorável, da excelente adaptação da rã touro e da tecnologia desenvolvida pelos produtores e pesquisadores brasileiros, a ranicultura constitui uma atividade importante no Brasil, particularmente no Estado de Goiás.

Com o melhoramento nos conhecimentos sobre manejo e alimentação, a ranicultura transformou-se em uma atividade superintensiva, com altas densidades de população e com estrita dependência dos alimentos balanceados. Entretanto, os métodos intensivos de cultivo favoreceram o aparecimento de doenças que constituem uma ameaça para a viabilidade técnica e econômica dos criatórios de organismos aquáticos (ROTTMAN et al., 1992; BONDAD-REANTASO et al., 2005).

Doenças com alta mortalidade caracterizadas clinicamente por edemas e ascite têm sido observadas reiteradamente em girinos. Esses quadros podem estar ou não acompanhados de sintomatologia nervosa e, às vezes, as mortes ocorrem de forma súbita. É fato comum que, em um mesmo surto, ocorram os diversos quadros clínicos que compõem a síndrome.

As septicemias têm sido reportadas como a causa mais importante de mortalidade em anfíbios, sendo frequente animais serem encontrados mortos sem sintomas premonitórios. Septicemias por estreptococos ocorrem de forma esporádica ou epizoótica em populações selvagens ou de criação em grande número de espécies aquáticas (ROMALDE et al., 2000; TORANZO et al., 2005). Diversos estudos realizados em rãs de criação têm relatado a presença de estreptococos associados a septicemias e surtos de mortalidade (GLORIOSO et al., 1974; AMBORSKI et al., 1983). A estreptococose tem sido identificada também em peixes como uma síndrome produzida por cocos Gram-positivos dos gêneros Streptococcus, Lactococcus, Enterococcus e Vagococcus (BERCOVIER et al., 1997; ELDAR et al., 1997). Particularmente, S. iniae tem sido indicado como o agente primário de doenças em diversas espécies de peixes e, ocasionalmente, de infecções em humanos, sendo considerada uma doença emergente (CDC, 1996; WEINSTEIN et al.. 1997; GREENLEES et al., 1998; DURBOROW, 1999; LEHANE & RAWLIN, 2000; FULLER et al., 2001; LAU et al., 2003).

Existe, contudo, grande incerteza em relação às características dessas patologias em anfíbios devido aos seguintes fatores: 1) sinais clínicos inespecíficos (CRAWSHAW, 1994); 2) etiologia pouco clara revelando a presença de diversos agentes oportunistas que atuam de forma conjunta, sendo que, na maioria das vezes, habitam o ambiente dos animais afetados; 3) condições particulares de manejo e alimentação artificial que, muito provavelmente, constituem causas predisponentes para transformação de um eventual agente comensal em um patógeno; e 4) falta de pesquisas sobre o tema dando continuidade aos estudos de casos (HIPÓLITO & BACH, 2002).

        No entanto, diversas pesquisas têm indicado os vírus pertencentes à família Iridoviridae, gênero Ranavirus como produtores de doenças severas em anfíbios. Os iridovírus que infectam animais aquáticos possuem uma distribuição mundial e estão associados a doenças severas. Os girinos têm maior suscetibilidade podendo sofrer mortalidade de até 100% da população. Em ranários da China, ZHANG et al. (2001) isolaram agentes do gênero Ranavirus de girinos da espécie Rana grylio, as quais apresentavam sinais de doença e mortalidade de até 90%. WENG et al. (2002) relataram a “doença da distensão abdominal” em girinos de criação da espécie Rana tigrina rugulosa, também na China. Os autores observaram quadros clínicos com mortalidade de 95%, os quais apresentavam abdome aumentado de tamanho, ataxia e redução da atividade. GREEN et al. (2002), estudando 44 surtos de doenças em anfíbios dos Estados Unidos, incriminaram os iridovírus em 25 casos, sendo 20 deles em girinos e cinco na espécie rã touro.

MAZZONI (2000) no Uruguai, suspeitou da participação de um agente viral pertencente à Família Iridoviridae, gênero Ranavirus, baseados em quadro clínico semelhante ao descrito por WOLF et al. (1968) para o vírus do edema do girino (TEV). O agente foi detectado em girinos de criação pela técnica de reação em cadeia da polimerase (GALLI et al., 2006) e confirmado como agente etiológico em surtos de alta mortalidade de girinos de até quatro semanas de idade (MAZZONI et al., 2009). Esses resultados corroboram a hipótese da possível etiologia viral para a doença aqui estudada.

Apesar desses achados, os ranavírus foram detectados também em anfíbios sadios (WOLF et al., 1968; ZUPANOVIC et al., 1998; ZHANG et al., 2001; GANTRESS et al., 2003, GREER et al., 2005), sendo que o poder patogênico desses agentes na fase pré-metamórfica da rã touro não está confirmado por enquanto.

Objetivou-se com o presente trabalho descrever um quadro infeccioso em girinos de criação na fase pré-metamórfica e verificar a participação de ranavírus como agente etiológico. Para tanto, foram realizadas pesquisas de agentes etiológicos, epizootiologia das doenças, sintomatologia clínica, anatomia patológica macroscópica, histopatologia, bacteriologia convencional e virologia, sendo esta por meio do emprego de técnicas moleculares, e a microscopia eletrônica de transmissão.

 
MATERIAL E MÉTODOS

 Foram estudados 350 girinos na fase pré-metamórfica a partir do estágio 26 (GOSNER, 1960), criados em três ranários localizados no Estado de Goiás, dois localizados no Município de Gameleira e um no Município de Hidrolândia, no período de 2003 a 2005. Todos os ranários utilizavam fontes de água superficial. A água dos tanques era constantemente renovada e a densidade mantida na faixa de um girino por litro de água.

Os girinos eram alimentados com rações fareladas contendo 45% de proteína bruta.

Toda vez que um tanque de criação era esvaziado, drenava-se a água e realizava-se a limpeza e desinfecção final com hipoclorito de sódio em concentração de 10 ppm.

Dados referentes à morbidade e mortalidade foram levantados pelos ranicultores mediante planilhas específicas.

Utilizaram-se 300 girinos de rã touro (Rana [Lithobates] catesbeiana) com sinais aparentes da doença e 50 girinos aparentemente sadios. Todos os espécimes foram transportados em sacos plásticos contendo água e analisados imediatamente no laboratório do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás.

Selecionaram-se preferencialmente girinos nos estágios iniciais da síndrome, não tendo sido utilizados animais mortos para evitar erros induzidos pelas alterações post-mortem (NACE, 1974).

Uma vez sacrificados por concussão craniana e corte da medula cervical (AVMA, 1993), os exemplares foram submersos em solução de ácido peracético a 0,2%. Após a abertura da pele e cavidade celômica, fígado, rins, baço e líquido ascítico foram retirados utilizando-se utensílios esterilizados para cada corte. As amostras foram processadas imediatamente segundo BARON et al., (1996), sendo inoculadas em caldos BHI (Brain Heart Infussion Broth), Casoy, (Tripticase Soy Broth), Glicose Azida e Selenito-Cistina. Todas as amostras foram incubadas a 30°C por 24-72 h. O período de incubação de 72 h deveu-se à multiplicação lenta de alguns estreptococos, procurando-se, dessa forma, dar tempo suficiente para seu desenvolvimento e, ao mesmo tempo, evitar a ocorrência de falsos negativos. Assim que foi observado o crescimento bacteriano, alíquotas foram semeadas em placas de ágar sangue contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro e incubadas a 30°C por um período máximo de 72 h, observando-se as características hemolíticas e morfológicas das unidades formadoras de colônias (UFC). As UFC isoladas e diferentes morfologicamente foram selecionadas para coloração de Gram e observação em microscópio de contraste de fase.

Os cocos Gram-positivos foram estudados mediante provas bioquímicas complementares. As UFC, identificadas primariamente pela bioquímica como estreptococos, foram enviadas para determinação da espécie no Aquatic Animal Health Research Laboratory em Auburn - Alabama, nos Estados Unidos. As culturas foram processadas pelo método de identificação de ácidos graxos da membrana, FAME (Fatty Acid Methyl Ester).

Os bastonetes Gram-negativos foram incubados em placas de ágar McConkey e as UFC selecionadas, inoculadas em tubos de TSI (Triple Sugar Iron Agar) e submetidas à bateria de testes bioquímicos para identificação da espécie.

Amostras de água e da ração foram analisadas periodicamente por técnicas bacteriológicas convencionais para determinação de contaminação fecal e presença de cocos Gram-positivos (BRASIL, 2003).

Fígado, rins e baço de girinos foram extraídos e preservados em formol tamponado a 10% (vol-vol) e processados segundo a rotina no Laboratório de Histopatologia do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Goiás pelos métodos de LUNA (1968). Os blocos parafinados foram seccionados em cortes de 4-5 µ e corados com hematoxilina-eosina (H&E) para as avaliações primárias das lesões. Adicionalmente, os cortes selecionados foram também corados pelo método de MacCallum-Goodpasture para visualização de bactérias em geral, pelo método de Fite para detecção de micobactérias e coloração de PAS para visualização de fungos.

Fígados, rins, baços e músculo de 50 girinos na pré-metamorfose foram processados. As amostras foram preservadas em etanol a 95% ou congeladas a menos 20°C até processamento no Laboratório de Biologia Molecular do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás. A extração do DNA foi realizada a partir de porções de 50 mg utilizando-se o método do fenol/clorofórmio (SAMBROOK et al., 1989).

Foram utilizados iniciadores direcionados a regiões conservadas no genoma dos iridovírus (Tabela 1). Para o gene que codifica a proteína imediata precoce (IE) ICP-18, utilizaram-se iniciadores propostos por GALLI et al. (2006) e, para o gene que codifica a proteína MCP, foram utilizados iniciadores localizados na extremidade 5´ da sequência (MAO et al., 1997), conforme apresentado na Tabela 1.

Foram também utilizados iniciadores direcionados à identificação da bactéria Streptococcus iniae, aplicando-se a metodologia de PCR proposta por BERRIDGE et al. (1998). Os cocos Gram-positivos, independentemente do gênero, foram purificados, sendo o DNA extraído pela metodologia do fenol/clorofórmio (SAMBROOK et al., 1989).

As amostras para Microscopia Eletrônica de Transmissão foram processadas no laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto Biológico de São Paulo. O material analisado foi selecionado a partir de lesões identificadas nas lâminas da histopatologia. Uma vez delimitada a região suspeita, a mesma foi localizada no bloco parafinado e realizado o corte de aproximadamente 1 mm de diâmetro. O fragmento extraído foi desparafinado, rehidratado e finalmente processado pela técnica de inclusão em resina, seguida de contrastação positiva de cortes ultrafinos de acordo com os procedimentos usuais de inclusão em resina, baseando-se nos métodos de LUFT, (1961) e GONZALES-SANTANDER, (1969). Os fragmentos de órgãos foram fixados em glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato 0,1M e pH 7,0, pós-fixados em tetróxido de ósmio a 2% em tampão fosfato 0,2M, pH 7,0, corados por acetato de uranila a 0,5%, desidratados em série cetônica crescente (50 a 100%) e incluídos em resina Spurr. Após ultra seccionamento dos blocos, os cortes foram corados positivamente pelo tratamento sequencial de acetato de uranila (WATSON, 1958) e citrato de chumbo (REINOLDS, 1963), antes de serem observados ao microscópio eletrônico de transmissão Philips EM 208.

Estudos da pele e das brânquias foram realizados a fresco, em microscópio ótico, mediante raspagens com lâmina de bisturi esterilizada (REICHENBACH-KLINKE & ELKAN, 1965).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os dados do presente estudo evidenciaram a existência de uma estreptococose septicêmica que acomete girinos na pré-metamorfose.  Observou-se uma síndrome caracterizada por morbidade baixa com alta letalidade, afetando 2 a 3% da população por dia. A doença apresentou-se com maior severidade durante o período de primavera-verão. A prevalência e incidência dos casos foram sempre maiores no ranário de ciclo completo onde o número de animais era também maior. A doença caracterizou-se por apresentar sinais inespecíficos, como letargia e edemas nas patas na fase inicial, e ascite e úlceras na pele nas etapas mais avançadas (Figura 1). Às vezes foram observados sinais nervosos como ataxia, natação errática ou em círculos, ou os girinos ficavam flutuando em posição invertida.

À necropsia, os girinos doentes mostraram diversos graus de lesões nos órgãos internos, mas sem padrão definido. As de maior frequência foram aumento do volume e coloração anormal do fígado, geralmente de cor cinzenta ou amarelada, baço aumentado de volume e com coloração pardo-escura e rins hemorrágicos.

Na histopatologia, girinos sem sinais aparentes de doença apresentaram rins com infiltração mononuclear abundante e fígado com diversos graus de esteatose e quantidade variável de granulomas em fases iniciais, com necrose central (Figura 2). O número de focos de melanomacrófagos distribuídos no fígado foi muito reduzido e, às vezes, ausente. A coloração de MacCallum-Goodpasture aplicada aos cortes histológicos dos dois órgãos revelou a presença de cocos Gram-positivos.

Os girinos doentes apresentavam lesões por sepse, caracterizadas por resposta inflamatória múltipla e granulomas bacterianos distribuídos no parênquima dos diversos órgãos, além de áreas de necrose associadas à presença de macrófagos e grande infiltração linfocitária. As lesões no fígado foram mais intensas na região centrolobular do que na região periportal. Observou-se esteatose hepatocitária, com perda da estrutura normal do tecido, associada, por vezes, à necrose. Macrófagos com cocos fagocitados constituíram um achado comum, sendo observada forte relação entre essa resposta e o aparecimento dos granulomas. Estes evidenciaram regiões necróticas circundadas por macrófagos e fibroblastos. Foi evidente a ausência de melanomacrófagos no parênquima do órgão.

Os rins apresentavam infiltração mononuclear às vezes focal e, outras, difusa, necrose glomerular e tubular, congestão e granulomas. Foram observados glomérulos com espessamento da membrana basal, aumento da celularidade, desaparecimento das alças, retração, atrofia e esclerose (Figura 3). Foi possível observar o depósito de material hialino nos glomérulos e abundantes cilindros hialinos nos túbulos. Esse tipo de lesão pode ser classificada como glomerulonefrite membranoproliferativa, evoluindo à esclerose, o que determina síndrome nefrótica seguida por insuficiência renal.

O estudo das secções pela coloração de MacCallum-Goodpasture revelou a presença de cocos Gram-positivos em grau variável associados às lesões observadas previamente na coloração H&E. Observaram-se cocos Gram-positivos nos glomérulos e no interstício, demonstrando que os microrganismos são carregados pelo sangue, produzindo lesões e granulomas. O quadro histopatológico é característico das infecções crônicas associadas a bactérias que sobrevivem dentro dos macrófagos após a fagocitose (AGIUS & ROBERTS, 2003).  As colorações de PAS e Fite foram negativas para a presença de fungos e micobactérias, respectivamente. Não foram identificados nos tecidos estudados corpúsculos de inclusão viral. Não foram observadas partículas virais nem lesões compatíveis com infecção por esses agentes no material analisado pela microscopia eletrônica.

As análises bacteriológicas apresentaram resultados inespecíficos. Não foi detectada a presença de uma única espécie bacteriana que pudesse ser incriminada como agente causal, mas os achados sempre corresponderam a cultivos mistos. As amostras de água e da ração não evidenciaram contaminação fecal ou presença de cocos Gram-positivos.

Todos os girinos estudados foram positivos para os cocos Gram-positivos dos gêneros Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus e Leuconostoc, associados a bastonetes Gram-negativos de diversos gêneros, sendo que 60% deles foram positivos para Aeromonas hydrophila e Citrobacter spp. e 35% para Pseudomonas spp. e Proteus spp. Dentre os cocos Gram-positivos, foram identificados principalmente Streptococcus uberis, S. agalactie, S. faecalis, S. dysgalactiae, e Enterococcus spp. Em todos os casos, os órgãos afetados com maior frequência foram o fígado, seguido pelo rim.

Unidades formadoras de colônias não tipificadas no laboratório foram identificadas pelo FAME como Enterococcus gallinarium, E. columbae, E. casseliflavus, Leuconostoc spp. e Aerococcus viridians.

Apesar do isolamento nas análises bacteriológicas de um variado tipo de microrganismos, foi constante a presença de cocos Gram-positivos. À histopatologia, as quantidades elevadas dessas bactérias dentro do parênquima dos órgãos indicaram o papel fundamental das mesmas no quadro. É importante ressaltar que esses microrganismos foram observados nos estágios prévios da doença, em amostras obtidas de girinos sem sinais evidentes, indicando que não pertencem aos invasores oportunistas. Os estreptococos potencialmente patogênicos podem ser albergados de forma assintomática por animais e humanos sadios, sendo controlados usualmente pelas defesas não específicas. A ação de fatores desencadeantes, a queda na imunidade, ou mudanças na virulência determinam o aparecimento dos sinais clínicos (MITCHELL, 2003; IICAB, 2005).

Esses achados sugerem que a patogênese do quadro é de uma lesão estreptocócica, não sendo possível, nas condições deste estudo, determinar a causa primária que antecedeu a invasão dos tecidos pelos estreptococos. Do equilíbrio entre a resposta imune, a quantidade e características dos microrganismos presentes e o grau de lesão pré-existente nos diversos tecidos, surge a severidade da doença nesse período específico.

Analises microbiológicas realizados em rãs de criação obtiveram resultados semelhantes aos do presente trabalho (GLORIOSO et al., 1974; AMBORSKI et al., 1983), indicando que esse tipo de infecções múltiplas é comum nesses animais. Da mesma forma, septicemias por estreptococos ocorrem de forma esporádica ou epizoótica em populações selvagens ou de criação em grande número de espécies aquáticas, constituindo um problema severo (ROMALDE et al., 2000; TORANZO et al., 2005).

As septicemias têm sido reportadas como a causa mais importante de mortalidade em anfíbios, sendo frequente o achado de animais mortos sem sintomas premonitórios. Os microrganismos do meio ambiente podem tornar-se patogênicos quando os anfíbios são submetidos a condições de estresse, sendo que a sintomatologia observada não depende do tipo de microrganismo envolvido (CRAWSHAW, 1994; GREEN et al., 2002; MAUEL et al., 2002; PASTERIS et al., 2006). Os resultados desta pesquisa corroboram com essas observações. A metamorfose constitui um período de acentuado estresse, portanto, parece lógico pensar que girinos debilitados podem adoecer ao longo do processo. A qualidade das rações oferecidas aos girinos, com elevado conteúdo em carboidratos e proteínas, pode, sem dúvidas, constituir-se na origem de alterações que levam à degeneração gordurosa do fígado, impedimento ou diminuição de suas funções metabólicas e sobrecarga dos rins que acabam sendo lesados. Esse tipo de síndrome hepato-renal é descrita, detalhadamente, na bibliografia científica em outras espécies, fundamentalmente em humanos (ROBBINS et al., 1996; GUINÉS, 2001). A sintomatologia predominante de edemas e ascites associada à presença de lesões importantes nos rins e fígado estão em concordância com essa doença. De igual forma, os sintomas nervosos observados na fase aguda da doença podem ter origem no quadro de encefalopatia hepática (COTRAN et al., 1994), no qual as toxinas não eliminadas pelo fígado chegam ao sistema nervoso central.

Girinos evidenciando edema e ascite foram negativos em 90% dos casos para os iniciadores direcionados a sequências conservadas dos ranavírus. As amostras positivas foram obtidas a partir de girinos sobreviventes de lotes afetados previamente pela virose nas primeiras semanas de vida. Não foi detectado S. iniae com os iniciadores utilizados.

Os estudos parasitológicos revelaram a presença de parasitas da pele cujas lesões recebem o nome genérico de “opacidade contagiosa da pele”, cujo protozoário mais frequentemente encontrado foi o Oodinum sp. A presença desses agentes pode ser considerada uma consequência do estado geral dos anfíbios, sendo secundária às infecções descritas acima.

 CONCLUSÃO

Foi observada a existência de uma estreptococose septicêmica secundária que acomete girinos na pré-metamorfose. A pesar do caráter secundário da infecção, o papel dos cocos Gram-positivos não pode ficar sem estimativa nas doenças dos girinos na fase pré-metamórfica e, portanto, devem ser levados em conta nos planos de controle sanitário dos ranários comerciais.

O papel dos ranavírus nesses girinos não foi demonstrado, sugerindo uma menor susceptibilidade nesse período de desenvolvimento dos girinos de Rana [Lithobates]  catesbeiana.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Dr. Phil Klesius pelo processamento e identificação de amostras bacterianas. O trabalho foi realizado com apoio da CAPES.

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