RESUMO
A identificação de
Salmonella
spp. em amostras de alimentos por diagnóstico microbiológico é
demorada, com aproximadamente cinco diferentes etapas, levando cerca de
120 horas até o resultado final. A utilização da técnica da reação em
cadeia da polimerase (PCR) pode diminuir esse período; entretanto,
substâncias presentes nas amostras podem afetar a reação. O objetivo
deste trabalho foi comparar a extração de DNA de
Salmonella enterica sorovar
Enteritidis
(SE), por tratamento térmico e pelo uso do cetyltrimethil ammonium
bromide (CTAB), em produtos provenientes de granjas avícolas,
correspondentes a matéria prima (farinha de carne) e a suabes de
arrasto experimentalmente contaminados. As amostras de DNA obtidas com
as extrações foram submetidas a PCR, utilizando-se um par de
oligonucleotídeos iniciadores para amplificação de DNA do gene
específico de SE – Sdf 1. Comparando-se os métodos de extração,
observou-se que quando do uso do CTAB detectou-se SE em 70% de matéria
prima e em 80% de suabes de arrasto, enquanto com o método por
tratamento térmico houve positividade em 20% de matéria prima e em 40%
de suabes de arrasto. Houve detecção de SE em ambos os métodos
utilizados para extração de DNA, porém, o uso de CTAB detectou maior
número de amostras positivas, quando comparado com o tratamento térmico.
PALAVRAS-CHAVES: PCR,
Salmonella enteritidis, ave, extração de DNA, CTAB.
ABSTRACT
COMPARISON OF DNA EXTRACTION METHODS IN POLYMERASE CHAIN REACTION FOR THE
DETECTION OF Salmonella enterica SEROVAR ENTERITIDIS IN POULTRY PRODUCTS
The identification of
Salmonella
spp. in food samples by microbiological diagnosis is time consuming,
with approximately five different stages, requiring about 120 hours
until the final result. The utilization of the polymerase chain
reaction technique (PCR) can reduce this time, but substances present
in samples may affect the reaction. The present work aimed to compare
DNA extraction by thermic treatment and by the use of cetyltrimethil
ammonium bromide (CTAB), in products originated from poultry houses
corresponding to raw material (meat meal) and experimentally
contaminated drag swabs. Materials obtained from the extractions were
submitted to PCR, utilizing a pair of initiator oligonucleotides for
amplification of Sdf 1 gene fragments. Comparing the methods of
extraction, it was observed that when CTAB was employed, SE was
detected in 70% of meat meal and in 80% of drag swabs, while the
thermic treatment method yielded positive results in 20% of meat meal
and in 40% of drag swabs. SE was detected under both methods utilized
for DNA extraction, but the use of CTAB detected a greater number of
positive samples, compared with thermal treatment.
KEYWORDS: PCR,
Salmonella enteritidis, chicken, DNA extraction, CTAB.
INTRODUÇÃO
Com a grande expansão da indústria avícola, a salmonelose tornou-se
fator limitante na criação de aves, adquirindo importância relevante,
pois as perdas econômicas estão presentes em todas as fases da criação,
ou seja, da produção ao consumo dos produtos de origem avícola (BARROW,
1993). Desta forma, a salmonelose representa uma severa barreira
sanitária e restringe o comércio de aves e seus produtos em todo o
mundo (BERCHIERI JÚNIOR & BARROW, 1995).
Os sorotipos de maior importância em saúde pública são
Typhimurium e
Enteritidis,
ambos de difícil controle, em função da complexidade de suas
epidemiologias que, envolvem grande número de reservatórios após a
excreção fecal e contaminação ambiental. Um programa de controle e
monitoramento bem administrado pode proporcionar melhorias no controle
da
Salmonella spp., em produtos de origem animal (FLORES
et al., 2001).
Os métodos microbiológicos são largamente empregados para detecção da
Salmonella
spp., embora o sucesso no controle das infecções seja dependente do
tempo e da precisão dos testes diagnósticos. Por isso, novas técnicas
de diagnóstico têm sido desenvolvidas, destacando-se a reação em cadeia
da polimerase (PCR), utilizada com êxito para detecção de vários
microrganismos (GAST, 1997).
RAHN
et al. (1992), usando um par de oligonucleotídeos de gene InvA, detectaram com sucesso 626 cepas de
Salmonella
spp. em 360 amostras testadas, a partir de uma colônia isolada e
incorporada direto na PCR. Os autores obtiveram sensibilidade de 99,4%
e especificidade de 100%, pois não se observou reação positiva em
controle negativo algum pertencente a outras 33 enterobactérias
testadas.
Segundo KONGMUANG
et al.
(1994), o custo de cada método de extração de DNA é também uma
preocupação. Tanto partículas como substâncias solúveis são
parcialmente removidas por centrifugação de baixa e alta velocidade.
Entretanto, algumas bactérias poderiam ser perdidas no processo; além
do mais, deve-se considerar a permanência de certas substâncias que
podem interferir na PCR, levando à diminuição da sensibilidade da
técnica.
Objetivou-se, com este trabalho, comparar a extração de DNA por
tratamento térmico e pelo uso do cetyltrimethil ammonium bromide (CTAB)
na PCR para detecção de
Salmonella enterica sorovar
Enteritidis
em produtos provenientes de granjas avícolas, correspondentes a matéria
prima (farinha de carne) e a suabes de arrasto experimentalmente
contaminados.
MATERIAL E MÉTODOS
A pesquisa foi realizada em produtos avícolas correspondentes a matéria
prima (farinha de carne) e a suabes de arrasto contaminados
experimentalmente com SE fagotipo 28. A bactéria foi cultivada em caldo
BHI (caldo infusão cérebro coração) por 24 horas a 37ºC, obtendo-se,
após contagem em diluição decimal, 108 unidades formadoras de colônia
(UFC) por mL. Porções de 25 g da matéria prima (cinquenta amostras)
foram transferidas individualmente para 225 mL de água peptonada. A
esses conteúdos adicionou-se 1,0 mL do cultivo de SE. Após a
contaminação artificial, as amostras foram homogeneizadas e incubadas a
40°C por 24 horas. Os suabes de arrasto (cinquenta amostras) foram
incubados em 225 mL de água peptonada, a 40°C, por 24 horas, acrescidos
de 1,0 mL do cultivo de SE.
As metodologias utilizadas para extração do DNA foram por tratamento
térmico e uso do CTAB. Para o tratamento térmico centrifugou-se cada
uma das amostras após a contaminação artificial a 10.000 rpm por cinco
minutos, em temperatura ambiente, sendo o sobrenadante desprezado e 1,0
mL de tampão TE (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA) pH 8,0, acrescido ao
pellet. O produto foi agitado em vortex, com posterior aquecimento a 95
°C por dez minutos, e centrifugado a 10.000 rpm por três minutos, a
4°C. Manteve-se o sobrenadante à temperatura de -20°C, para posterior
utilização na PCR (OLIVEIRA 2002).
O protocolo de extração do DNA utilizando CTAB foi realizado segundo
OLIVEIRA (2002). Ao microtubo que continha 250 µL de cada uma das
amostras, após a contaminação artificial, foram adicionados 100 µL de
cloreto de sódio (NaCl) 5 M e 100 µL de CTAB pré-aquecido a 65°C. A
suspensão foi agitada por dez segundos até obter-se aspecto leitoso,
com posterior incubação a 65 °C por dez minutos. Após esse período
adicionaram-se 750 µL de clorofórmio-álcool-isoamílico (24:1),
agitando-se por dez segundos com movimentos leves e em seguida
centrifugando-se em temperatura ambiente por cinco minutos, a 16.000
rpm.
O sobrenadante foi transferido para novo tubo e adicionaram-se 450 µL
de etanol absoluto a -20°C, incubando-se durante dez minutos a -20°C.
Em seguida foi centrifugado durante vinte minutos a 16.000 rpm, a 4°C,
eliminando-se o álcool e acrescentando-se 500 µL de etanol a 70% em
temperatura ambiente, seguindo-se o mesmo procedimento de centrifugação
anteriormente citado. O álcool foi eliminado novamente e o microtubo
contendo o pellet foi submetido a secagem a 56 °C no banho seco
(Termolyne). Após a completa secagem do pellet, adicionaram-se 50 µL de
tampão de diluição (10 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA) pH 8,0 previamente
aquecido a 56°C. As amostras de DNA foram mantidas em temperatura
ambiente por vinte minutos e posteriormente armazenadas à temperatura
de -20°C até sua utilização na PCR.
O par de oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação do
DNA foi sintetizado com base nas sequências 5’ TGT GTT TTA TCT GAT GCA
AGA GG 3’ (primer 1) e 5’ CGT TCT TCT GGT ACT TAC GAT GAC 3’ (primer 2)
para o gene específico de
Salmonella enterica sorovar
Enteritidis - Sdf 1 citado por AGRON
et al. (2001).
A PCR foi realizada em termociclador (Eppendorf AG Mastercycler
Gradient) com volume final de 100 mL. Foram depositados nos microtubos
10 mL de tampão para PCR 10x, 1 mL de cloreto de magnésio (MgCl
2),
5 mL de cada um dos oligonucleotídeos (40 rmol), 0,5 mL DNA Taq
polimerase (1U), 2 mL de cada dNTP (2,5 mM), 65,50 mL, água ultrapura e
10 mL de DNA da amostra de Salmonella. Obedeceram-se aos seguintes
ciclos: 94°C por im minuto para desnaturação inicial, 27 ciclos de 94°C
por trinta segundos, 58°C por trinta segundos, 72°C por im minuto e um
ciclo de extensão final de sete minutos a 72°C. Os produtos da PCR
foram analisados em gel de agarose a 1,5%, contendo brometo de etídio.
Como marcador de peso molecular, utilizou-se DNA ladder 100 pb e a
visualização foi realizada em transiluminador.
Os resultados foram analisados estatisticamente pelo teste do
Qui-quadrado, comparando-se os resultados positivos e negativos em
ambos os métodos de extração (ZAR, 1984).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os métodos para extração do DNA utilizados neste estudo propiciaram a identificação de SE (
Figura 1),
porém a metodologia com o uso de CTAB detectou maior número de amostras
positivas, em relação ao método por tratamento térmico (
Tabela 1).
A detecção de SE utilizando-se CTAB foi significativamente diferente do
método térmico nos dois materiais avícolas testados. Tanto na farinha
de carne quanto nos suabes de arrasto, o uso do CTAB determinou 50% e
40% a mais de amostras positivas, respectivamente, quando comparado com
o método térmico, sugerindo que a falha na identificação de SE em
amostras positivas com o uso deste método poderia determinar prejuízos
significativos ao estabelecimento avícola.
Ao utilizar a técnica de RAPD-PCR, TREVANICH
et al.
(2010) obtiveram resultados semelhantes aos do presente trabalho,
quando comparadas as técnicas de CTAB e tratamento térmico. Além de
maior sensibilidade na hora da extração de DNA, como observado neste
estudo, houve também redução significativa no tempo de detecção.
FLORES
et al. (2001),
utilizando os métodos por fenol-clorofórmio e tratamento térmico,
demonstraram resultados significativos a favor da metodologia por
fenol-clorofórmio na detecção da
Salmonella em ovos. LAGATOLLA
et al. (1996), ao realizar PCR para detectar
Salmonella
proveniente de diferentes materiais clínicos, compararam também os
métodos por fenol-clorofórmio e tratamento térmico para extração de
DNA, não observando diferença significativa entre as metodologias
testadas.
Dois métodos de extração de DNA bacteriano presente em alimentos foram testados por DICKINSON
et al.
(1995). O primeiro utilizou tampão com proteinase K para lisar
rapidamente as células e solubilizar as amostras. O segundo foi
realizado com tolueno e mutanolisina para lise celular e solubilização
com tiocinato de guanidina. Em ambos, o DNA foi precipitado com
isopropanol, determinando resultados semelhantes entre os métodos de
extração testados.
Ao comparar a qualidade do produto extraído e amplificado por nested-PCR em gel de sacarose, SIMIONATTO
et al.
(2005) verificaram que o produto obtido por CTAB apresentava qualidade
de nitidez (sem a formação de bandas inespecíficas) superior à do
obtido pelo método com dodecil sulfato de sódio, e qualidade semelhante
à do produto extraído pelo método de fenol-clorofórmio, porém com menos
intensidade comparando-se com o método de extração com tiocinato de
guanidina.
Ao estabelecer um programa de monitoramento para
Salmonella,
a indústria avícola procura reduzir as perdas econômicas e a
disseminação do agente, garantindo assim melhor qualidade
microbiológica de seus produtos. A realização da PCR em produtos
avícolas tem sido possível, mas determinados procedimentos de extração
de DNA podem incrementar sua eficácia, uma vez que elevadas
concentrações de proteínas, cálcio e sais biliares, entre outros,
presentes nas amostras, poderiam reduzir a eficiência do método
utilizado.
CONCLUSÃO
Os dois métodos de extração de DNA na PCR utilizados neste trabalho,
tanto em farinha de carne quanto em suabes de arrasto experimentalmente
contaminados, foram úteis para detecção de SE. O método de CTAB
apresentou maior sensibilidade que o método por tratamento térmico,
sendo, então, o seu uso mais aconselhável na implantação em rotina
laboratorial ou pesquisa.
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