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EFEITO DO TEMPO E DA TEMPERATURA DE REFRIGERAÇÃO NO DESENVOLVIMENTO DE MICRORGANISMOS PSICROTRÓFICOS EM LEITE CRU REFRIGERADO COLETADO NA MACRORREGIÃO DE GOIÂNIA, GO

Priscila Alonso dos Santos,¹ Marco Antônio Pereira da Silva,² Cleusely Matias de Souza,³ Jacira dos Santos Isepon,⁴ Antônio Nonato de Oliveira⁵ e Edmar Soares Nicolau⁵

1. Instituto Federal Goiano, Campus Rio Verde, GO
2. Instituto Federal Goiano, Campus Rio Verde, GO. E-mail: marcotonyrv@yahoo.com.br
3. Universidade Federal de Goiás, Campus de Jataí, GO
4. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquisa Filho”, Campus de Ilha Solteira, SP
5. Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás.

RESUMO

O objetivo da pesquisa foi avaliar o efeito do tempo de estocagem e da temperatura de refrigeração sob a contagem de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos em amostras de leite cru refrigerado. No período de agosto a setembro de 2005 coletaram-se 34 amostras de leite cru refrigerado de tanques de expansão, sendo 29 individuais e cinco coletivos. Para a coleta das amostras seguiu-se uma rota determinada pela indústria localizada na macrorregião de Goiânia, GO. Para a avaliação microbiológica, foi realizada a contagem-padrão em placas de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos. Para a determinação e quantificação do caseinomacropeptídeo (CMP), adotou-se a metodologia proposta em BRASIL (1991). A contagem de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos aumentou com o tempo de estocagem do leite cru refrigerado. Observou-se o funcionamento inadequado do termostato dos tanques de expansão, podendo ocasionar prejuízos principalmente ao produtor de leite. Não foi constatada a presença de CMP pela cromatografia líquida de alta eficiência.

PALAVRAS-CHAVES: Leite in natura, proteólise, Pseudomonas spp.

ABSTRACT

EFFECT OF TIME AND TEMPERATURE OF REFRIGERATION IN THE DEVELOPMENT OF PSYCHROTROPHIC MICRORGANISMS IN COOLED RAW MILK COLLECTED IN THE MACROREGION OF GOIÂNIA, GO

The objective of the research were evaluated the effect of storage time and of refrigeration temperature under the counting of psychrotrophics microrganisms and proteolytics psychrotrophics in refrigerated raw milk samples. In the period of August the September of 2005 34 refrigerated raw milk samples were collected of refrigeration tanks, being 29 individuals and five collectives. Milk was proceeding from bovine flocks. For the collection of the samples followed a route determined for the industry located in the macroregion of Goiânia – GO, Brazil. For the microbiological evaluation was carried the standard plate count method of psychrotrophics microrganisms and proteolytics psychrotrophics. For the determination and quantification of the glycomacropeptide (GMP) were adopted methodology proposal in Brazil (1991). The counting of psychrotrophics microrganisms and proteolytics psychrotrophics increased with the storage time of refrigerated bovine milk. Were observed the inadequate tanks were observed e presence of GMP for the High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was not evidenced.

KEY WORDS: Proteolysis, Pseudomonas spp, raw milk.

INTRODUÇÃO

Com a granelização do leite na propriedade rural, a produção passou a ser entregue a qualquer hora do dia, já que os tanques de expansão garantem a qualidade do leite por até 48 horas. As vantagens da granelização são evidentes, pela possibilidade de transporte do leite refrigerado em caminhões-tanque isotérmicos, o que resulta na diminuição da contagem de microrganismos do leite.
Segundo NERO et al. (2005), a adoção do resfriamento do leite nas propriedades e a granelização da coleta são importantes medidas para melhorar a qualidade microbiológica do leite. No entanto, a refrigeração por períodos prolongados pode comprometer a qualidade do leite cru, devido à possibilidade de seleção de bactérias psicrotróficas proteolíticas. Por essa razão são necessários investimentos contínuos em boas práticas para prevenção do crescimento microbiano na cadeia produtiva do leite, para reduzir problemas tecnológicos e econômicos na indústria de laticínios (PINTO et al., 2006).
O leite que chega ao laticínio em temperatura elevada apresenta maior atividade microbiana e menor tempo de redutase, de modo que a higiene na ordenha e na manipulação do leite é determinante para a qualidade, o que está relacionado à contaminação inicial e à temperatura de manutenção até o beneficiamento (PONSANO et al., 1999).
De acordo com a Resolução IN 51/2002, do Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) (BRASIL, 2002), no sistema de coleta a granel, os tanques de refrigeração por expansão direta devem ser dimensionados para permitir a refrigeração do leite à temperatura igual ou inferior a 4ºC, no período máximo de três horas após o término da ordenha. A temperatura máxima de conservação do leite é de 7ºC na propriedade rural e de 10ºC no estabelecimento processador. A IN 51/2002 estabelece ainda que o tempo transcorrido entre a ordenha e o recebimento do leite no estabelecimento industrial deve ser de, no máximo, 48 horas, recomendado como ideal um período não superior a 24 horas.
Antes da introdução da refrigeração, a principal microbiota deterioradora do leite e produtos lácteos eram bactérias mesófilas fermentadoras da lactose, que causam rápida acidificação em leite não refrigerado. O uso da refrigeração associado aos períodos mais longos de armazenamento selecionou uma microbiota deterioradora denominada psicrotrófica (ARCURI, 2003). Porém, o leite produzido sob condições adequadas de higiene e refrigerado a temperaturas iguais ou inferiores a 4ºC apresenta baixa contagem de psicrotróficos (COUSIN, 1982).
Os microrganismos psicrotróficos em condições de refrigeração mantêm sua capacidade de multiplicação e tendem a se tornar predominantes na microbiota do leite cru após dois a três dias (SANTOS & FONSECA, 2003).
Para FOX (1989), as bactérias psicrotróficas, aparentemente, não são significativas quanto à proteólise, a menos que a população exceda 10⁶ UFC/mL.
Em função do curto tempo de geração a temperaturas de refrigeração, o gênero Pseudomonas spp representa as bactérias psicrotróficas deterioradoras predominantes do leite cru refrigerado, particularmente Pseudomonas fluorescens.
As proteases produzidas por bactérias psicrotróficas agem sobre a caseína de forma semelhante à quimosina, liberando o caseinomacropeptídeo (CMP) (DATTA & DEETH, 2001). Segundo SØRHAUG & STEPANIAK (1997), essas enzimas não apresentam sítio de clivagem específico, hidrolisam a κ-caseína, podendo também agir sobre as αs1 e β-caseínas.
Um dos métodos utilizados para monitorar a ação proteolítica é a determinação do caseinomacropeptídeo (CMP) por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), pois se trata de um método analítico quantitativo de detecção de soro em leite.
A CLAE ocupa um lugar de destaque para análise, dada sua facilidade em efetuar a separação, identificação e quantificação das espécies químicas. É um método físico-químico de separação de componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes entre duas fases, que estão em contato íntimo. Uma das fases permanece estacionária, enquanto a outra se move através dela. Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, os componentes da mistura são distribuídos entre as duas fases, de tal forma que cada um dos componentes é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais desses conjuntos (COLLINS et al., 1997).
Os microrganismos psicrotróficos são limitantes da qualidade do leite e derivados, pois as enzimas produzidas resistem ao processo de pasteurização. As variações da contagem desses microrganismos durante a estocagem do leite sob refrigeração podem ser explicadas pelas diferentes temperaturas e tempos de estocagem. Considerando esses aspectos, o objetivo deste trabalho foi investigar a qualidade do leite cru na propriedade rural, mediante avaliação dos efeitos da temperatura de refrigeração e do tempo de estocagem na composição da microbiota contaminante do leite e a possível presença de proteólise.

MATERIAL E MÉTODOS

O estudo foi realizado no Laboratório de Microbiologia do Centro de Pesquisa em Alimentos da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás.

Colheita das amostras
Foram coletadas amostras de leite cru refrigerado de 34 tanques de expansão, sendo 29 individuais e cinco coletivos, de propriedades rurais, seguindo-se uma rota determinada pela indústria localizada na macrorregião de Goiânia, GO, no período de agosto a setembro de 2005.
As amostras foram coletadas após a homogeneização do leite por agitação mecânica programada no próprio tanque. Em seguida, coletaram-se 500 mL de leite, utilizando-se um coletor de aço inoxidável e frascos esterilizados. Procedeu-se à colheita de seis amostras com 24, 48, 72, 96, 120 e 216 horas de estocagem, as quais foram acondicionadas em caixas isotérmicas contendo gelo, sendo enviadas ao Centro de Pesquisa em Alimentos para análise. A temperatura do leite foi aferida no momento da coleta, no termostato do tanque de expansão e com o uso de termômetro com graduação variando de -10ºC a 110ºC.

Análises laboratoriais

Contagem-padrão em placas de microrganismos psicrotróficos viáveis
Prepararam-se as diluições das amostras pipetando-se, assepticamente, 25 mL da amostra transferindo-as para um frasco tipo Erlenmeyer contendo 225 mL de água peptonada 0,1% (diluição 10^-1). A partir dessa diluição, procedeu-se ao preparo de diluições decimais até 10^-6, empregando-se o mesmo diluente. Uma vez diluídas, adicionaram-se 1 mL das diluições em placas de Petri (15x100) esterilizadas e 15 a 17 mL de ágar-padrão para contagem, fundido, resfriado a 45ºC e homogeneizado (APHA, 2001). Esse procedimento foi realizado em duplicata. Após a solidificação do ágar em temperatura ambiente, incubaram-se invertidas as placas a 7°C/10 dias (MARSHALL, 1992). As contagens foram realizadas em contador de colônias, em placas com 25 a 250 colônias. Para o cálculo do número de UFC/mL da amostra, multiplicou-se o número de colônias, em cada placa, pelo inverso da diluição inoculada.

Contagem-padrão em placas de microrganismos psicrotróficos proteolíticos
Foram preparadas as diluições das amostras pipetando-se, assepticamente, 25 mL da amostra, sendo transferidas para um frasco tipo Erlenmeyer contendo 225 mL de água peptonada 0,1% esterilizada (diluição 10^-1). A partir dessa diluição, prepararam-se diluições decimais até 10^-6, empregando-se o mesmo diluente.
Após a realização das diluições decimais, procedeu-se à adição de 1 mL das diluições em placas de Petri esterilizadas e 15 a 17 mL de ágar-leite (ágar-padrão acrescido de 10% de leite em pó desnatado reconstituído a 10%, preparado recentemente, fundido e resfriado a 45°C. As placas foram incubadas a 21°C/72 horas (MARSHALL, 1992).
As colônias de microrganismos proteolíticos apresentam-se rodeadas por uma zona clara, o que é resultado da conversão da caseína em compostos nitrogenados solúveis. Como o meio é opaco, utiliza-se um precipitante químico (ácido acético 10%) para detectar a proteólise e, assim, verificar se as zonas claras são causadas por proteólise ou pela formação de ácidos devida à fermentação de carboidratos. Efetuou-se a contagem de colônias que possuíam halo transparente ao seu redor e calculou-se o número de UFC/mL da amostra multiplicando-se o número de colônias, em cada placa, pelo inverso da diluição.

Contagem de Pseudomonas fluorescens
Uma amostra de 2,5 mL de leite cru refrigerado foi adicionado em 5 mL de caldo tripticaseína e soja – TSB – e incubado a 21ºC/18 horas. Após, transferiu-se uma alíquota de 0,1 mL da solução para placas contendo de 15 a 17 mL de Pseudomonas Cetrimide Agar (Oxoid, England), adicionado de 10% de glicerol. Este foi distribuído nas placas e solidificado em temperatura ambiente. Transferiu-se o inócuo de 0,1 mL de leite homogeneizado para a placa, sendo homogeneizado com uma alça de Drigalski e incubado a 21ºC/48 horas, para observação do crescimento de colônias. Na presença de P. fluorescens, as colônias apresentam-se amarelo-esverdeadas quando observadas à luz ultravioleta (KING, 1954).

Cromatografia líquida de alta eficiência
Para a determinação e quantificação do CMP adotou-se a metodologia proposta em legislação (BRASIL, 1991). Para a determinação do teor de soro mediante a técnica da CLAE, fez-se uma curva-padrão utilizando-se leite genuíno, de procedência conhecida. Para o preparo, adulterou-se o leite com soro de leite de composição-padrão, nas proporções de 5%, 10%, 15% e 20%, de acordo com o recomendado pela metodologia oficial (BRASIL, 1991). Para o preparo da amostra a ser analisada, 22 mL de leite foram tratados com 10 mL da solução de ácido tricloroacético (TCA) a 24%, sendo em seguida realizada a incubação a 25ºC/60 minutos em banho-maria, em repouso. Após esse período, realizaram-se duas filtrações: a primeira em filtro qualitativo (Whatman nº. 40, England), descartando-se aproximadamente cinco mililitros do filtrado, e a segunda em filtro MILLIPORE de 0,45 μm.
A determinação cromatográfica foi realizada com a injeção de 20 μL do filtrado no cromatógrafo (GILSON 118 UV/VIS, EUA), operando em vazão de 1 mL/min, e a detecção na faixa do UV-VIS em comprimento de onda de 205 nm, com a linha de base já devidamente estabilizada.
Efetuou-se corrida cromatográfica em aparelho de cromatografia líquida de alta eficiência (GILSON 321, EUA), com uma bomba isocrática (GILSON 306, EUA), com injetor automático (ASTED-XL, GILSON, EUA) e looping de 200 μL e coluna (Zorbax GF-250 Bioséries, Agilent, EUA) de 9 mm de diâmetro interno por 250 mm de comprimento. A fase estacionária da coluna era composta por partículas esféricas de sílica, modificadas na superfície por zircônio estabilizado. A fase ligada era composta por monocamada molecular hidrofílica com diâmetro de poro de 150 Å. A solução da fase móvel usada na separação foi um padrão fosfato com pH 6.
Elaborou-se um gráfico de porcentagem de soro versus a intensidade do sinal do detector, ou altura do pico, calculando-se a equação da reta de regressão, sendo aceitos valores de r ≥ 0,95. Procedeu-se à comparação do cromatograma da amostra com o do leite adicionado de soro e em seguida identificou-se o pico com o mesmo tempo de retenção do soro e calculando-se a porcentagem de soro na amostra, por interpolação da leitura do sinal na reta de regressão do leite adicionado de soro. De acordo com as normas (BRASIL, 1991), a prova é considerada positiva quando a presença de soro for superior a 1%, determinado a partir da curva-padrão nos picos com o mesmo tempo de retenção do CMP.

Análise estatística
Para a análise estatística dos dados, desenvolveu-se análise de variância mediante o uso do Sistema SAEG, versão 9.5 (2007). No caso de efeito significativo, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (P<0,05).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

De acordo com as normas (BRASIL, 2002), é permitida a estocagem do leite na propriedade rural por até 48 horas. Na presente pesquisa, o tempo de estocagem variou de 24 a 216 horas. Tempos de estocagem maiores que os permitidos pela legislação brasileira estão associados à capacidade de armazenamento dos tanques de expansão, os quais permitem a estocagem do leite cru refrigerado por longos períodos, reduzindo, com isso, os custos com o frete. Durante o período estudado, foi observada uma baixa produção de leite na rota de coleta a granel.
A estocagem do leite cru refrigerado por períodos maiores que 48 horas é preocupante, pois reflete negativamente na qualidade do leite cru refrigerado e dos produtos obtidos, afetando principalmente o rendimento final dos derivados lácteos.
A contagem de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos expresso em Log de UFC/mL foi crescente até as 216 horas de estocagem do leite na propriedade rural (Tabela 1). Pode-se observar que as médias das temperaturas estavam de acordo com a legislação (BRASIL, 2002), que estabelece temperatura abaixo de 7ºC para a estocagem do leite cru refrigerado na fonte de produção. No entanto, em uma das amostras coletadas com 48 horas de armazenamento, a contagem de psicrotróficos foi de 5,5x10⁵ UFC/mL com temperatura de 9ºC, estando, portanto, fora dos padrões estabelecidos pela legislação.
Os resultados da contagem de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos diferiram significativamente de 24 horas para 216 horas de estocagem do leite cru refrigerado na fonte de produção. Foi observado um aumento crescente da contagem desse grupo de microrganismos à medida que aumentou o tempo de armazenamento.
Deve haver um controle rigoroso com relação ao tempo de estocagem e à temperatura do leite na propriedade rural, pois se o leite bovino for submetido a período de estocagem longo sob refrigeração, como o encontrado neste estudo, o controle de microrganismos psicrotróficos na matéria-prima será mais importante do que o realizado após o seu processamento. Isso porque não é possível recuperar um leite de qualidade insatisfatória, além de diminuir a vida de prateleira do produto pode vir a ocasionar problemas tecnológicos e econômicos. A legislação não especifica um valor de microrganismos psicrotróficos em leite cru refrigerado, mas sabe-se que a redução do rendimento na fabricação de queijos ocorre quando a contagem da população de psicrotróficos no leite cru excede 10⁶ UFC/mL de leite.
SCHMITH et al. (2003), analisando a contagem de microrganismos psicrotróficos em leite cru de diferentes regiões do Rio Grande do Sul, encontraram 16,66% das amostras com contagens entre 10⁵ a 10⁶ UFC/mL e 83,34% com contagens acima de 10⁷ UFC/mL, o que também denota níveis elevados de contaminação. NERO et al. (2005) mostraram que 48,57% das amostras de leite cru coletadas nos Estados de Minas Gerais (Viçosa), Rio Grande do Sul (Pelotas), Paraná (Londrina) e São Paulo (Botucatu) não atendem à legislação, relatando que fatores de higiene, armazenamento e capacitação de pessoas influenciam na qualidade do leite.
No presente trabalho, 14% das amostras apresentaram contagem-padrão de microrganismos psicrotróficos de 106 UFC/mL, e 20% apresentaram contagens de 10⁵ UFC/mL. Vale assinalar que a carga microbiana do leite cru refrigerado é de extrema importância para a qualidade final dos produtos lácteos, pois interfere significativamente na vida de prateleira. Resultado maior foi encontrado por SANTOS & FONSECA (2003), sendo que 90% das amostras de leite cru coletadas individualmente em tanques de expansão apresentaram contagem de psicrotróficos superiores a 10⁶ UFC/mL.
De acordo com SØRHAUG & STEPANIAK (1997), um dos principais fatores que influenciam na qualidade da matéria-prima mantida a 7ºC, ou menos, por períodos prolongados, é a multiplicação da microbiota psicrotrófica contaminante produtora de proteases termoestáveis.
Com relação ao tempo de armazenamento do leite cru na propriedade rural pode ser observado, na Figura 1, que 38,24% das amostras foram coletadas dentro do prazo previsto pela legislação, que é de no máximo 48 horas, e 61,76% das amostras foram coletadas com até 216 horas de estocagem, favorecendo o desenvolvimento de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos.
Sete amostras (20,58%) foram positivas para a presença de Pseudomonas fluorescens. Em duas delas o tempo de estocagem era de 48 horas, uma amostra apresentava temperatura de 6ºC e a outra 11ºC. Três amostras foram positivas no tempo de armazenamento de 72 horas. Destas, duas estavam a 4ºC e uma amostra a 12ºC. No tempo de estocagem de 120 horas, duas amostras revelaram a presença de P. fluorescens.
A temperatura lida no termostato do tanque de expansão no momento da coleta difere da temperatura lida com o termômetro utilizado no estudo, ou seja, existe uma interpretação errônea dos resultados quando a temperatura é lida somente no termostato do tanque (Figura 1). Faz-se necessário dar mais ênfase à temperatura expressa pelo termostato do tanque, o qual deve ter uma calibração mais eficaz ou ser aferido constantemente.
De acordo com a Figura 1, foi possível observar que trinta amostras (88,24%) de leite cru refrigerado apresentaram temperatura igual ou inferior à determinada pela legislação (BRASIL, 2002). Quatro (11,76%) estavam em desacordo com a referida instrução, que determina como temperatura ideal 7ºC ou menos no período de três horas após a ordenha, sendo a temperatura máxima de chegada do leite na indústria de 10ºC.
GRIFFITHS et al. (1987) observaram uma redução de 25% na contagem de microrganismos psicrotróficos no leite cru ao reduzirem a temperatura de refrigeração durante a estocagem de 6ºC para 2ºC. COSTA et al. (2002), estudando a espécie de microrganismos psicrotróficos P. fluorescens, constataram aumento significativo na produção de proteases em leite estocado a 6ºC após 72 horas, quando a concentração celular era de, aproximadamente, 10⁷ UFC/mL. Esses autores observaram que, após certo tempo de estocagem (72 horas), já é possível encontrar quantidades razoáveis de enzimas no leite cru.
Quando o leite é mantido sob condições higiênico-sanitárias adequadas, psicrotróficos representam menos de 10% da microbiota total do leite fresco, comparado a mais de 75%, quando o leite é obtido sob condições não satisfatórias (NIELSEN, 2002).
O resultado encontrado no presente estudo para a presença de caseinomacropeptídeo (CMP) no leite cru refrigerado armazenado em tanque de expansão por diferentes tempos de armazenamento e temperatura foi negativo para todas as amostras. Os dados indicam que amostras de leite cru com alta contagem de bactérias psicrotróficas e psicrotróficas proteolíticas não possuem, necessariamente, atividade proteolítica mais elevada em comparação com amostras de contagem baixa. Deve-se levar em consideração o tipo de microbiota contaminante e a atividade de enzimas endógenas do leite. Neste trabalho 20,58% das amostras apresentaram-se positivas para P. fluorescens, não sendo positiva a presença de caseinomacropeptídeos na análise de CLAE.
No entanto, pesquisas revelam que o leite, mesmo sob refrigeração, permite o crescimento, a produção e a atividade de proteases bacterianas. ADAMS et al. (1976) detectaram degradação da κ-caseína antes de a população bacteriana atingir 10⁴ UFC/mL. A β-caseína foi mais degradada que a α-caseína. Alguns psicrotróficos (cepas de Pseudomonas) também degradaram as proteínas do soro.
REINHEIMER et al. (1990) realizaram estudos na Europa e Estados Unidos e observaram a ocorrência de Pseudomonas. De 321 espécies de psicrotróficos, 223 eram Gram negativos, sendo que 51,1% desse total eram Pseudomonas. Entretanto, em trabalho de isolamento realizado por PRABHA et al. (1994), o gênero constituiu a maior população, seguido por AeromonasPseudomonas.
De acordo com THOMAS & THOMAS (1973), a população de microrganismos necessária para causar mudanças indesejáveis no leite varia de acordo com os diferentes gêneros e espécies. As mudanças bioquímicas resultantes do crescimento de bactérias psicrotróficas no leite passam a ser significativas quando as contagens superam 10⁶ UFC/mL. Amostras de leite cru com populações iniciais de 10⁴ UFC/mL podem exceder 10⁶ UFC/mL quando armazenada a 7ºC por dois dias ou a 5ºC por três dias (LAW et al., 1979).

CONCLUSÕES

A contagem de microrganismos psicrotróficos e psicrotróficos proteolíticos no leite cru refrigerado aumentou durante o tempo de estocagem em tanques de expansão por até 216 horas.
Observou-se diferença entre a temperatura registrada no termostato do tanque de expansão com a temperatura aferida no termômetro, resultando em prejuízos à cadeia do leite.
Não foi constatada a presença de caseinomacropeptídeo nas amostras de leite cru refrigerado armazenadas por até 216 horas na fonte de produção.

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Protocolado em: 19 mar. 2008. Aceito em: 15 out. 2009.