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AVALIAÇÃO CLÍNICO-ANDROLÓGICA EM TOUROS NELORE E TESTES DE VIABILIDADE ESPERMÁTICA, INTEGRIDADE DE ACROSSOMA E FRAGMENTAÇÃO DE CROMATINA AO LONGO DE TRÊS ESTAÇÕES REPRODUTIVAS

Rogério Orfaly Addad,¹ Gustavo Eduardo Freneau,¹ Lorenna Cardoso Resende¹ e Leonardo Marçal da Silva²

1. Laboratório de Andrologia e Tecnologia do Sêmen, Escola de Veterinária, UFG, Caixa Postal 131, Campus II, CEP 74001-970, Goiânia-GO.
Tel/Fax: (62) 3521 1585, e-mail: gfreneau@gmail.com
2. Médico Veterinário da CLASSEVET.

RESUMO

Com os objetivos de verificar a evolução da qualidade dos ejaculados de touros da raça Nelore ao longo três anos, através do exame clínico-andrológico associado de testes de viabilidade espermática, integridade de acrossoma e a fragmentação da cromatina, e estabelecer relações entre estas características e com a prenhez com grupos de diferentes tipos de fêmeas, utilizaram-se 46 touros da raça Nelore com idade entre 30 e 120 meses, para avaliação da qualidade seminal e da aptidão reprodutiva. Os animais foram mantidos em condições extensivas, com alimentação a pasto, recebendo suplementação mineral e servindo um rebanho com 3.782 fêmeas de várias categorias (novilhas, vacas primíparas e pluríparas). Realizaram-se colheitas de dados que abrangiam medidas de circunferência escrotal e avaliação do sêmen colhido por eletroejaculação e avaliaram-se as características físicas (volume, turbilhonamento, motilidade, vigor), morfológicas (defeitos maiores, menores e totais) e de integridade espermática (integridade de membrana plasmática, de acrossoma e de cromatina) no período que antecedeu três estações de monta consecutivas (2003, 2004 e 2005). Submeteram-se os dados à analise de variância, compararam-se as médias pelo teste SNK e calculou-se o coeficiente de correlação de Pearson utilizando o SAS. Os touros apresentaram circunferência escrotal de 33,8 ± 2,8cm, 15,6 ± 8,5% de defeitos espermáticos totais, 40,1 ± 23,1% de gametas com membrana e acrossoma íntegros e 8,8 ± 3,8% de cromatina fragmentada. As relações entre circunferência escrotal, as características físicas, morfológicas e de integridade espermática e o desempenho reprodutivo do rebanho foram baixas e não significativas (P>0,05). As características reprodutivas dos touros permaneceram dentro de padrões aceitáveis ao longo de três anos de avaliação. Nos touros deste experimento, os defeitos espermáticos, a integridade de membrana plasmática, integridade de acrossoma e fragmentação de cromatina nuclear não foram frequentes a ponto de comprometer a qualidade seminal e o desempenho reprodutivo dos animais. Não houve relação entre os defeitos espermáticos com a integridade acrossômica e/ou a fragmentação da cromatina nuclear. Não houve relação entre a prenhez com as características apresentadas pelos touros estudados

PALAVRAS-CHAVES: Acrossoma, cromatina, espermatozoides, Nelore, reprodução, sêmen, touros.

ABSTRACT

BREEDING SOUDNESS EXAMINATION IN NELORE ZEBU BULLS AND SPERM VIABILITY, ACROSSOME AND CHROMATIN INTEGRITY ASSAY FOR THREE BREEDING SEASONS

This work aimed to verify the evolution of seminal quality in zebu Nellore bulls in three years by the breeding soundness examination and integrity of plasmatic membrane, acrosome and chromatin and establish relationships among those characteristics and the pregnancy with different females groups. Forty six bulls with age between 30 and 120 months were used to evaluation of the seminal quality and the reproductive aptitude. The animals had been kept in extensive conditions, with feeding the grass, receiving mineral supplementation and serving a herd with 3,782 females of some categories (heifers and cows). Data enclosed measured of scrotal circumference and evaluation of the semen collected by eletroejaculation and evaluated the physical characteristics (volume, mass activity, motility, strong), morphologic (major, minor and total defects) and spermatic structure integrity (integrity of plasmatic membrane, acrosome and chromatin) in this period had been carried through that preceded three consecutive mating season (2003, 2004 and 2005). The data had been submitted analyze of variance, the averages compared for test SNK and the coefficient of correlation of Pearson was calculated using the SAS. The bulls presented scrotal circumference of 33.8 ± 2.8cm, 15.6 ± 8.5% of total spermatic defects, 40.1 ± 23.1% of gametes with normal membrane and acrosome and 8.8 ± 3.8% of fragmented chromatin. The relations between scrotal circumference, physical and morphologic characteristics, spermatic integrity and the reproductive performance of the herd had been low and not significant (P< 0.05). The bulls reproductive characteristics showed acceptable standards in three years. The sperm defects, plasmatic membrane and acrosome integrity, fragmented chromatin had not high frequency to compromise the seminal quality. There are not relationships among sperm defects with acrosome integrity and fragmented chromatin. No relationships was observed between pregnancy and bull reproductive characteristics.

KEY WORD: Acrosome, bulls, cattle, chromatin, nelore, reproduction, sperm defects.

INTRODUÇÃO

O principal objetivo do touro em um sistema de acasalamento por monta natural é de emprenhar todas as fêmeas disponíveis, num período de tempo o mais curto possível na estação. Portanto, é indispensável que o reprodutor seja capaz de identificar, realizar a cobertura e depositar no trato reprodutivo da fêmea um número suficiente de espermatozoides (FRENEAU et al., 2000). Neste contexto, o exame clínico-andrológico tem sido amplamente empregado, como método indicador da aptidão reprodutiva dos touros designados a servir em estação de monta ou doação de sêmen. Entretanto, essa avaliação tem-se mostrado aquém do necessário, para determinar de maneira segura essa condição (SILVA, 1998). Sendo assim, não basta ao touro apresentar padrões seminais aceitáveis para morfologia espermática, motilidade progressiva, vigor e percentual de espermatozoides normais. A principal característica a ser avaliada para estimar o potencial fecundante do sêmen é a qualidade dos embriões produzidos e se seu desenvolvimento posterior ocorre de forma normal (WALTERS et al., 2005a).
Portanto, o diagnóstico do potencial fecundante de um ejaculado é essencial para a eficiência reprodutiva, já que o uso de reprodutores subférteis pode trazer consequências desastrosas para o rebanho. Para tanto, são fundamentais o desenvolvimento e a aplicação de técnicas de diagnóstico que permitam avaliar a qualidade do sêmen e que ofereçam resultados consistentes (SILVA et al., 1998). Os testes laboratoriais que avaliam as características estruturais dos elementos espermáticos envolvidos diretamente na fertilização (membrana plasmática, acrossoma e cromatina nuclear) proporcionam importante contribuição para a análise, interpretação e determinação de padrões, sem que ocorra o comprometimento da qualidade seminal e do sucesso (SILVA, 1998; EVENSON et al., 1999).
Os objetivos deste trabalho foram verificar a evolução da qualidade dos ejaculados de touros da raça Nelore ao longo três anos através do exame clínico andrológico associado de testes de viabilidade espermática, integridade de acrossoma e a fragmentação da cromatina e estabelecer relações entre essas características e com a prenhez com grupos de diferentes tipos de fêmeas.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizaram-se 46 touros da raça Nelore com idade média de 67,8 ± 18,6 meses para avaliação clínico-andrológica antes do início do período de acasalamento, durante três estações de monta consecutivas (anos de 2003, 2004 e 2005), produzindo 108 amostras de sêmen, e para os testes de viabilidade espermática, integridade de acrossoma e fragmentação de cromatina.
Os touros foram destinados a uma estação de monta de 120 dias, servindo 1.248 fêmeas (202 novilhas, 372 vacas primíparas, 627 vacas multíparas e 69 vacas solteiras) agrupadas em dez lotes de acasalamento com 35 touros, no ano de 2003; 1.270 fêmeas (190 novilhas, 358 vacas primíparas, 617 vacas multíparas e 83 vacas solteiras) agrupadas em três lotes de acasalamento com 38 touros, no ano de 2004; e 1.264 fêmeas (209 novilhas, 307 vacas primíparas, 652 vacas multíparas e 96 vacas solteiras) agrupadas em três lotes de acasalamento com 35 touros em 2005.
Ao final das estações de 2003 e 2004 obteve-se o percentual de prenhez por meio de palpação retal. Na estação de 2005, houve a necessidade de se misturar os lotes de acasalamento dos touros, em virtude de acidentes nas pastagens da propriedade, perdendo-se, assim, a caracterização dos diferentes lotes. Os animais foram mantidos em pastagem de Andropogon gayanus e Brachiaria brizantha (divididas e manejadas sob orientação técnica) durante todo o período experimental, recebendo sal mineral ad libitum.
Para a avaliação andrológica dos touros, mensurou-se a circunferência escrotal e em seguida colheu-se o sêmen pelo método de eletroejaculação. Foram avaliadas as características físicas do ejaculado (movimento em massa ou turbilhão, motilidade progressiva e vigor) segundo técnicas de rotina (CBRA, 1998).
Posteriormente, procedeu-se ao envio de amostras fixadas em solução formol-salino ao laboratório para avaliação morfológica espemática, preparando-se lâminas úmidas observadas em microscopia de contraste diferencial de interferência de fase sob imersão (aumento de 1.000x). Foram contados duzentos espermatozoides por lâmina, os quais foram classificados conforme o percentual de gametas normais, defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais (BLOM, 1973).
A viabilidade espermática e a integridade de acrossoma foram determinadas pelo método de coloração dupla por Tripan Blue e Giemsa (TBG), adicionando-se uma gota de sêmen de 20µL a outra gota de 20µL de solução corante de Trypan Blue 0,4% em criotubo por vinte minutos a 37ºC. Após encubação, centrifugou-se a amostra a 700 gravidades durante seis minutos, sendo esse processo de centrifugação repetido até que a solução apresentasse cor azul-pálido (SILVA et al., 1998). Posteriormente, efetuaram-se dois esfregaços e após a secagem as lâminas foram fixadas em metanol por cinco minutos e imergidas em Giemsa por 24 horas. Após a lavagem e secagem das lâminas, avaliou-se o esfregaço em microscopia de campo claro por imersão. Contaram-se duzentas células e estimou-se o percentual de espermatozoides vivos ou mortos com acrossoma íntegro ou acrossoma lesado (alguma alteração morfológica ou de coloração) no sêmen.
Para a avaliação da integridade da cromatina espermática – forma natural (fita dupla) ou desnaturada (fita simples ou fragmentada) –, foi aplicada a técnica de coloração com laranja de acridina (LA) modificada, proposta por TEJADA et al. (1984), nos anos de 2003 (35 touros avaliados), 2004 (38 touros avaliados) e 2005 (35 touros avaliados), totalizando 108 análises a partir de amostras de sêmen fixado em formol salino. Utilizaram-se 20 µL de sêmen adicionado em um criotubo com solução salina e procedeu-se à centrifugação por dois minutos a 37ºC em 200g, repetindo-se o processo duas vezes. Após a última lavagem, o sobrenadante foi retirado e preparou-se o esfregaço em uma lâmina. Após a secagem, fixou-se o esfregaço em solução de metanol-ácido acético (3:1) por 24 horas. Após esse período, foi empregada a coloração de LA por cinco minutos, seguida pela lavagem com água destilada. Após a secagem, a lâmina foi observada em microscopia de fluorescência.
Foi adotado o delineamento estatístico a partir dos cálculos dos valores médios e desvio-padrão da idade, condição corporal, CE, das características físicas, morfologia espermática, viabilidade espermática, integridade de acrossoma e de cromatina. Submeteram-se os dados resultantes à análise de variância e compararam-se as médias pelo teste SNK (entre grupos de acasalamento e estações de monta). O índice de correlação de Pearson entre as variáveis dependentes – CE, características físicas e morfológicas do ejaculado, viabilidade espermática, integridade de acrossoma e de cromatina e taxa de prenhez – foi calculado pelo SAS (1997), segundo o modelo matemático:

Y_{i j k} = μ + T + Fi + El + e_{i j k}, em que:

Y_{i j k} = variáveis dependentes;
μ= média de todas as observações;
T= efeito do touro; F= efeito da categoria de fêmea servida pelos touros de índice i, sendo i= 1(novilhas), 2 (primíparas) e 3 (vacas); E_j= efeito do período de coleta do sêmen de índice j, sendo j= 1(estação de monta 2003), 2 (estação de monta 2004) e 3 (estação de monta 2005); e_{i j k} = erro aleatório residual.
A comparação da prenhez dentro do ano e categoria de fêmeas foi realizada pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis (SAS, 1997).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Na Tabela 1 estão apresentadas as características reprodutivas estudadas no sêmen dos touros junto com dados de todos os grupos de acasalamento. A média geral nos três anos de observação dos defeitos maiores (10,1%), menores (5,6%) e totais (15,6%) são semelhantes aos encontrados por MARTINEZ et al. (2000) para touros da raça Gir (7,86%, 5,09% e 12,95%, respectivamente), por FITZPATRICK et al. (2002) para touros da raça Brahman (defeitos totais: 11,9%) e por SILVA et al., (2002) para touros da raça Nelore (9,5%, 3,1% e 12,6%, respectivamente). Porém, foram maiores que os relatados por GALVANI (1998) em touros da raça Nelore (4,04%, 3,12% e 7,16%, respectivamente), que atribuiu como causa para esses resultados as condições de manejo e nutrição dos rebanhos. Apesar disso, não pode ser descartado que essas diferenças sejam devidas às técnicas utilizadas na avaliação da morfologia espermática (FRENEAU et al., 2009).
A relação fêmea–touro ao longo dos três anos foi de 37,3 ± 7,1, não apresentando, possivelmente, efeito sobre a taxa de prenhez dos diferentes grupos de acasalamento. Não houve correlação entre o número de fêmeas por touro com a prenhez geral. Essa tendência contradiz estudos prévios que relataram maior prenhez em grupos de cinquenta fêmeas por touros confrontados com os de vinte e cinco (FRENEAU et al., 2008).
Os touros tiveram sua aptidão reprodutiva avaliada nas sucessivas estações de monta (Tabela 2). Na primeira avaliação (ano 2003), apenas um touro foi considerado inapto. Já em 2004, recomendou-se o afastamento de cinco animais e na estação de 2005 todos os reprodutores foram considerados aptos para a reprodução. O exame clínico-andrológico diagnosticou a condição reprodutiva individual dos touros, indicando o descarte de 16,6% dos animais utilizados neste experimento.
As patologias espermáticas encontradas mais frequentemente foram defeitos de acrossoma (achatado no ápice), cabeças pequenas, decapitadas, diademas e crateras, cabeças subdesenvolvidas, estreitas, curtas, largas e decapitadas, defeitos de peça intermediária (peça filiforme, grossa, delgada), caudas enroladas na cabeça e na peça intermediária, gotas citoplasmáticas proximais e distais.
Esses defeitos estão comumente associados a distúrbios do mecanismo de termorregulação testicular, sendo também observados em touros que foram tratados com dexametasona, indicando que o estresse provocado pelo calor ou por práticas de manejo é a forma mais comum de injúrias interferindo na espermatogênese (BARTH & OKO, 1989; KASTELIC et al., 1997). Neste experimento, as causas dos defeitos espermáticos não tiveram sua origem determinada.
As correlações entre volume, turbilhonamento, motilidade, vigor, defeitos maiores, menores, com a CE, foram baixas e próximas de zero, e semelhantes às obtidas por MARTINEZ et al. (2000) e por SILVA et al. (2002), para touros da raça Gir e Nelore, respectivamente. Este fato possivelmente se deve à presença, na população de touros, de animais na idade adulta, em que essas relações entre o crescimento somático e testicular se perdem após o período de puberdade e maturidades sexual, como comprovado em touros da mesma raça (FRENEAU et al., 2006).
Além da estimativa dos elementos tradicionais do exame andrológico, foram realizadas provas para avaliar a viabilidade espermática, a integridade do acrossoma, a integridade da cromatina, e seus efeitos no desempenho reprodutivo dos touros. Em duas avaliações andrológicas pré-estação de monta (2003 e 2005), possivelmente devido ao aumento da acidez do corante Giemsa, a técnica de coloração dupla não apresentou resultados satisfatórios. Entretanto, no exame pré-estação de monta 2004, foi possível a aplicação da coloração dupla para viabilidade espermática e integridade de acrossoma. A qualidade dos esfregaços permitiu visualizar também vários defeitos espermáticos (Figura 1). Neste estudo, o valor médio obtido para número de espermatozoides vivos com o acrossoma intacto foi de 40,1 ± 23,1%, sendo inferior aos resultados reportados anteriormente por SILVA et al. (2002) e por TARTAGLIONE & RITTA (2004), de 54,9 ± 9,9% e 51,2 ± 4,5%, respectivamente. Esses percentuais foram considerados baixos para sêmen fresco, possivelmente devido à influência de fatores externos, como a restrição e carência nutricional da época em que se coletou o sêmen (pré-estação de monta 2004) ou pelo repouso sexual prolongado entre os períodos de monta. Não houve correlação entre as características integridade acrossômica com os defeitos de acrossoma na morfologia espermática.
Não foram observadas correlações significativas entre a CE com o percentual de gametas normais, com a integridade de cromatina ou com o desempenho reprodutivo dos touros na estação de monta. Essas baixas relações possivelmente reflitam o bom estado dos touros adultos (SALISBURY et al., 1978; HALLAP et al., 2006). Provavelmente testículos de menor tamanho e ejaculados com anormalidades elevadas atinjam o quadro da morfologia espermática e a fertilidade dos touros.
No que se refere à estrutura da cromatina espermática, o percentual de cromatina fragmentada (8,8 ± 3,8%) deste estudo (Tabela 1) foi maior do que o valor encontrado por SILVA et al. (2002), para mestiços Nelore (1,6 ± 1,7%), porém semelhante ao de JANUSKAUSKAS et al. (2001), que trabalharam com animais taurinos (8,0 ± 1,6%). Essa variabilidade já foi reportada por BOCHENEK et al. (2001), que observaram em amostras de sêmen de raças taurinas avaliadas e aprovadas nos testes de controle de qualidade das centrais (morfologia, motilidade e resistência ao congelamento) uma grande amplitude no percentual de gametas com cromatina fragmentada de 1,2% a 23,8%. Além disso, estudos realizados por WALTERS et al. (2005b) consideraram razoável a possibilidade de espermatozoides com cromatina fragmentada penetrarem o oócito, dando prosseguimento no desenvolvimento embrionário, porém a viabilidade desses embriões estaria comprometida.
Neste estudo a porcentagem de espermatozoides com estrutura da cromatina desnaturada não apresentou correlações significativas, com a idade, CE, motilidade progressiva, defeitos totais com os percentuais de gametas normais, defeitos maiores e menores, defeitos de acrossoma. Observou-se correlação de pequena intensidade com a taxa de prenhez do rebanho (r= 0,25; P<0,05), o que estaria de acordo com os resultados de estudos anteriores (DOBRINSKI et al., 1994; HALLAP et al., 2005). Entretanto, vários trabalhos demonstraram haver correlação alta e significativa entre a qualidade do DNA espermático com a idade (KARABINUS et al., 1990), com os defeitos primários e secundários, com a motilidade (BALLACHEY et al., 1988; SHIBAHARA et al., 2003; BELETTI & MELLO, 2004; PERIS et al., 2004), com a integridade de acrossoma, com a viabilidade espermática (BALLACHEY et al., 1988; PERIS et al., 2004) e com a fertilidade dos touros (BOCHENEK et al., 2001; JANUSKAUSKAS et al., 2001). Todos esses estudos empregaram a citometria de fluxo e o protocolo de avaliação de estrutura da cromatina espermática. Essa técnica permite analisar um percentual de espermatozoides muitas vezes maior e detecta diferenças que não podem ser evidenciadas com a microscopia óptica (KARABINUS et al., 1990). Isto leva a considerar a influência de fatores extrínsecos, como sensibilidade da técnica (KARABINUS et al., 1990) e o tamanho da amostra, e principalmente de fatores intrínsecos, como o estado da espermatogênese desses touros aqui estudados (HALLAP et al., 2006) e o efeito do plasma seminal agindo como uma barreira física ou ainda a maior fixação do DNA espermático pelo formol, diminuindo o acesso do corante à cromatina (ROCHA et al., 2002).
Analisando os dados entre as estações de monta (Tabela 2), notou-se que a CE não apresentou diferença ao longo dos anos. No entanto, no último ano (2005), o turbilhonamento sofreu redução, a motilidade apresentou valores equivalentes ao longo das estações, o vigor iniciou em 2003 uma trajetória de queda que se estendeu até a estação do ano de 2005, entretanto os valores dessas características seminais permaneceram dentro dos padrões de normalidade (CBRA, 1998). Trata-se de resultados que concordam com os de RODE et al. (1995), que verificaram alterações nas características físicas do sêmen e o aumento no percentual de defeitos morfológicos, em touros submetidos a dietas deficientes em vitamina A, confirmando os efeitos deletérios, porém reversíveis, da carência nutricional sobre as características seminais (SILVA et al., 1992; RODE et al., 1995). Uma vez removida essa restrição nutricional no ano seguinte (2005), o percentual de gametas normais voltou a valores equivalentes aos do primeiro ano do experimento. Houve uma diferença significativa entre as porcentagens de prenhez observadas entre as estações reprodutivas de 2003 e 2004. Apesar de ter havido também diferenças entre os defeitos de cabeça, maiores e totais, não se acredita que elas possam ter modificado o quadro de prenhez do rebanho. Possivelmente, fatores diferentes a esses possam ter interferido.
Na Tabela 3 estão apresentadas as características reprodutivas dos touros estudados de acordo com a categoria de fêmeas nos grupos de acasalamento. Houve diferença (P<0,05) entre as porcentagens de prenhez observadas nas três categorias de fêmeas. Entre as características reprodutivas dos touros só os defeitos espermáticos de cabeça foram diferentes (P<0,05) entre as categorias de fêmeas, porém com valores perto do aceitável (8,6% nas primípararas). Estes achados levam a supor que a diferença de prenhez observada seja devida aos grupos de fêmeas e não às características estudadas nos touros que acasalaram elas.

CONCLUSÕES

As características reprodutivas dos touros permaneceram dentro de padrões aceitáveis ao longo de três anos de avaliação. Nos touros deste experimento, os defeitos espermáticos, a integridade de membrana plasmática, a integridade de acrossoma e a fragmentação de cromatina nuclear não foram frequentes a ponto de comprometer a qualidade seminal e o desempenho reprodutivo dos animais. Não houve relação entre os defeitos espermáticos com a integridade acrossômica e/ou a fragmentação da cromatina nuclear. Não houve relação entre a prenhez com as características apresentadas pelos touros estudados.

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Protocolado em: 28 fev. 2008. Aceito em: 1o set. 2009.