DOI: 10.1590/1809-6891v15i328351

CARACTERIZAÇÃO DE Aeromonas spp ISOLADAS DE AMOSTRAS DE OSTRAS E ÁGUA POR MÉTODO MICROBIOLÓGICO E MOLECULAR

Ana Carolina Miranda de Melo Silva¹, Daniele Lopes do Nascimento² Rosângela Zacarias Machado³, Francisca Neide Costa⁴

¹Pós Graduanda da Universidade Estadual do Maranhão, São Luiz, MA, Brasil.
²Médica Veterinária, Universidade Estadual do Maranhão, São Luiz, MA, Brasil.
³Professora Doutora da Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, SP, Brasil.
⁴Professora Doutora da Universidade Estadual do Maranhão, São Luiz, MA, Brasil - francisca.cca.uema@gmail.com

RESUMO

Objetivou-se isolar e identificar bactérias do gênero Aeromonas de amostras de ostras e de água, pelos métodos microbiológico e molecular. A identificação do gênero Aeromonas foi realizada pelo método convencional e pela técnica da PCR e a caracterização das espécies foi realizada pela chave de identificação Aerokey II e pela técnica de RFLP-PCR do 16S rDNA. Foram identificadas 59 (98,3%) amostras de ostras e 15 (75%) amostras de água contaminadas por bactérias do gênero Aeromonas. Dos 74 isolados de Aeromonas spp. obtidos pela análise microbiológica, 53 (71,62%), 38 (65,51%) de amostras de ostras e 15 (100%) de amostras de água, confirmaram a caracterização do gênero pela técnica molecular. Quanto a identificação bioquímica das espécies 59,3% (n=35) e 40,6% (n=24) dos isolados de Aeromonas sp. obtidos das amostras de ostras foram classificados como A. hydrophila e A. caviae, respectivamente; e para os isolados obtidos das amostras de água, 60% (n=9) foram classificados como A. hydrophila e 40% (n=6) como A. caviae; entretanto, somente a A. hydrophila foi confirmadapelo sequenciamento genético. Quanto a classificação através da RFLP-PCR 16S rDNA, foram obtidos padrões de bandas inespecíficos, impossibilitando a identificação das espécies por esta técnica. O grande número de amostras de ostras contaminadas com Aeromonas spp. e a identificação da A. hydrophila  demonstram que este molusco pode oferecer risco à saúde dos consumidores, principalmente por ser consumido in natura e se tratar de um micro-organismo potencialmente patogênico para o ser humano.
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PALAVRAS-CHAVE: água, Aeromonas, ostras, PCR.

CHARACTERIZATION OF Aeromonas spp ISOLATED FROM WATER AND OF OYSTERS SAMPLES BY MICROBIOLOGICAL AND MOLECULAR METHODS

ABSTRACT

INTRODUÇÃO

As intoxicações alimentares causadas por bactérias patogênicas de origem marinha são normalmente decorrentes do consumo de ostras cruas, de produtos pesqueiros crus, defumados, fermentados e salgados e de crustáceos crus ou insuficientemente cozidos¹. As ostras são normalmente consumidas in natura e, neste caso, os moluscos são ingeridos como um todo, levando à transmissão de micro-organismos potencialmente patogênicos para o consumidor, fato que aumenta o risco de doenças transmitidas por alimentos, especialmente quando esses moluscos são provenientes de áreas contaminadas ou tratados em condições higiênico-sanitárias precárias².

Surtos de doenças bacterianas de origem alimentar são reportados em todo o planeta, alguns causados por agentes denominados clássicos, como Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens e Salmonella spp., mas a grande maioria é ocasionada por bactérias emergentes, entre as quais as do gênero Aeromonas³. A Organização Mundial da Saúde (OMS), em 2002, e a Agência de Proteção Ambiental (EPA) dos Estados Unidos, em 2006, descreveram o gênero Aeromonas como patógeno emergente. Esse gênero tem recebido atenção especial nos últimos anos, por estar relacionado com várias doenças em humanos e animais e, principalmente, pela sua potencialidade de patógeno oportunista em indivíduos imunodeprimidos⁴. Bactérias do gênero Aeromonas são amplamente difundidas no meio ambiente, estando presentes nos meios aquáticos, nos animais e nos alimentos. Seu isolamento em produtos de origem animal foi relatado por diversos pesquisadores em diferentes partes do mundo, sendo que a grande maioria está associada ao pescado⁵, dentre os quais se destacam as ostras. Além disso, neste papel de “patógeno secundário”, as Aeromonas têm sido implicadas como potenciais causadoras de gastrenterites e infecções extra-intestinais, incluindo as infecções de feridas, pneumonia, síndrome urêmica hemolítica, peritonites, sépsis biliares e septicemias⁶.

Dessa forma, a identificação rápida dos agentes causadores das doenças de origem alimentar é um passo importante para a tomada de decisão em casos de surtos. Para o isolamento das bactérias do gênero Aeromonas, os métodos microbiológicos são largamente empregados, porém, devido à necessidade de se diminuir o tempo de isolamento e aumentar a precisão dos testes diagnósticos aliado a dificuldade de padronização dos resultados bioquímicos⁷, tem-se utilizado ferramentas moleculares para diagnóstico, destacando-se a reação em cadeia pela polimerase – PCR⁸ e as técnicas de Polimorfismo de Fragmento de Restrição Lento (RFLP- Restriction Fragment Length Polymorphism) do 16S rDNA⁹.

Assim, devido à importância das bactérias do gênero Aeromonas como micro-organismos patogênicos para o ser humano, principalmente no que diz respeito à sua implicação na saúde pública, e devido à escassa literatura científica sobre a presença deste patógeno em ostras, objetivou-se com este trabalho isolar e caracterizar as bactérias do gênero Aeromonas em amostras de água e ostras pelos métodos bioquímicos e moleculares.

MATERIAL E MÉTODOS

Utilizaram-se, neste estudo, 60 amostras de ostras e 20 amostras de água, obtidas de locais de cultivo e pesca nos municípios de Raposa e Humberto de Campos no Estado do Maranhão-Brasil. A amostragem das ostras foi realizada conforme metodologia utilizada por Pereira et al.², na qual cada amostra de ostra foi constituída de 12 unidades e as técnicas de coleta, armazenamento e transporte foram realizadas obedecendo-se ao Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos¹⁰. O material oriundo das ostras foi mantido em Caldo Tripticase Soja (TSB), adicionado de ampicilina, e as amostras de água foram filtradas em membranas de éster de celulose, as quais foram picadas e os fragmentos colocados em Erlenmeyer, contendo 100 mL de TSB, e incubadas em estufa à temperatura de 28 ºC por 24 horas¹¹.  Alíquotas dos caldos de enriquecimento seletivo foram semeadas em ágar dextrina-ampicilina e ágar vermelho de fenol-amido-ampicilina e incubadas à temperatura de 28 ºC por 24 horas. As colônias sugestivas, em número de até cinco por amostra, foram semeadas em Ágar Tripticase Soja (TSA) inclinado e incubadas em estufa à temperatura de 28 ºC, por 24 horas.

Para a identificação do gênero Aeromonas,realizou-se a coloração de Gram e as culturas que apresentavam forma de bastonetes retos e curtos e gram-negativas foram repicadas em Ágar Tríplice-Açúcar-Ferro (TSI) e incubadas à temperatura de 28 ^oC por 24 horas. As culturas que apresentaram reação ácida foram repicadas em TSA e submetidas às provas da oxidase e da catalase, considerando-se como Aeromonas spp. os cultivos positivos nestas provas. A caracterização dos isolados de Aeromonas spp foi realizada utilizando-se a chave de classificação Aerokey II¹².

As bactérias com perfil fenotípico de Aeromonas spp foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida de restrição enzimática para caracterização das espécies bacterianas. A PCR foi realizada utilizando-se um par de iniciadores, com base nas sequências do 16S rDNA, gênero-específico para o gênero Aeromonas (Aero16-Fw 5’-TGACGTTACTCGCAGAAGA-3’ e Aero16-rev 5’-GCTTGCAGCCCTCTGT ACG-3’), proposto por Uehara¹³, em que sua amplificação resulta em um fragmento de 787 bp. Foi usada como controle positivo uma cepa de referência de Aeromonas hydrophila ATCC 7966, gentilmente cedida pela Fundação Oswaldo Cruz/Rio de Janeiro. As reações de amplificação foram realizadas em volumes de 25 μL, contendo 3 μL de DNA (50ug/μL); 5μL de tampão 5x; 1,5 mM de cloreto de magnésio; 200 μM DNTP; 0,2 μM de cada iniciador, 1,25U de Taq polimerase (Invitrogen) e água Milli Q q.s.p25μL e para amplificação foi utilizado um ciclo inicial a 95 ºC por cinco minutos; 30 ciclos compreendendo desnaturação a 95 ºC por um minuto, anelamento a 66 ºC por um minuto e extensão a 72 ºC por um minuto; e um único ciclo de extensão final a 72 ºC por cinco minutos e manutenção a 4 ºC.

Para a identificação das espécies, foi realizada a técnica de RFLP-PCR, gene 16S rDNA, segundo protocolo proposto por Borrell et al.⁹. Para amplificação do gene foram utilizados os primers 16SAer-F 5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’ e 16SAer-R 5’- GGTTACCTT GTTACGACTT-3’⁹. As reações de amplificação foram realizadas em volumes de 50 μL, contendo 2μL de DNA; 5 μL de tampão 10x; 1,5 mM de cloreto de magnésio; 0,2mM de DNTP; 1 μL de cada iniciador, 2U de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e água Milli Q q.s.p 50 μL e para amplificação foi empregado um ciclo inicial a 93 ºC por três minutos; 35 ciclos compreendendo desnaturação a 94 ºC por um minuto, anelamento a 56 ºC por um minuto e extensão a temperatura de 72ºC por dois minuto; e um único ciclo de extensão final a 72 ºC por 10 minutos e manutenção a 4ºC.

Todas as amostras de DNA de Aeromonas spp. foram submetidas a PCR com os primers gênero-específico e cerca de 250 μL do amplicom resultante foram purificados utilizando-se o Kit de Purificação (Purextreme­ Silica Bead DNA Gel Extraction Kit, Fermentas). Os produtos purificados foram submetidos ao sequenciamento genético, em um sequenciador automático ABI 3730 XL, conforme recomendações sugeridas pelo fabricante do equipamento (Applied Biosystems).

As sequências obtidas foram analisadas e comparadas com as sequências depositadas no GenBank, pelo programa BLASTn. Para um alto nível de qualidade das sequências, admitiram-se índices de confiança para cada nucleotídeo acima de 97% e níveis de identidade de sequência acima de 93%, em que E = 0.0.

Os dados foram analisados pelo teste de Qui-quadrado ou teste de Fisher, com nível estipulado de significância de 5%.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados da caracterização bioquímica dos isolados demonstraram que 98,3% (n=59) e 75% (n=15) das ostras e das águas, respectivamente, estavam contaminadas por Aeromonas spp. A identificação do gênero Aeromonas pela PCR demonstrou que 38 (65,51%) dos isolados obtidos de amostras de ostras e 15 (100%) dos isolados das amostras de água foram confirmadas e caracterizadas como pertencentes ao gênero da bactéria em estudo, ou seja, 71,62% (n= 53) do total dos isolados foram identificados como Aeromonas spp pelo método molecular. Aplicando-se o teste do Qui-quadrado para verificar a interdependência dos resultados frente ao teste diagnóstico efetuado, verificou-se que houve dependência dos testes (x²=11,59; P=0,0007), ou seja, os resultados obtidos podem variar de acordo com o teste usado.

Na Figura 1 estão apresentados os resultados da caracterização molecular do gênero Aeromonas de apenas 31 isolados obtidos de amostras de ostra e água, onde se observa que os isolados com um fragmento de 787 pb, a semelhança do controle positivo (Aeromonas hydrophila ATCC 7966), confirmam ser pertencentes ao gênero Aeromonas.

Os percentuais de contaminação das ostras encontrados nesta pesquisa foram superiores aos encontrados por Evangelista-Barreto et. al.¹⁴, os quais isolaram amostras de Aeromonas spp. em 50% das ostras analisadas de um criadouro natural, no estuário do rio Cocó (Fortaleza/Ceará/Brasil). Já Gomes¹⁵ isolou Aeromonas sp. em 10,7% das amostras de ostras comercializadas na cidade de São Paulo, enquanto Colakoglu et al.¹⁶ identificaram 66% (n=84) amostras de ostras, procedentes de mercados de peixes locais e de cozinhas de hotéis na região de Dardanelos/Turquia, contaminadas por Aeromonas spp.

O grande percentual de amostras de água contaminadas por Aeromonas indicam que os locais são impróprios para a pesca e cultivo de ostra, sendo necessária a realização de algum tipo de tratamento antes da comercialização e consumo desse alimento.

Corroborando com estas afirmações, Galvão et al.¹⁷ afirmaram que a contaminação de águas costeiras pode ameaçar seu uso potencial para o cultivo de moluscos bivalves, pois, sendo organismos filtradores, têm capacidade de concentrar e acumular altas densidades de micro-organismos. Desta forma, é importante ressaltar que o tratamento das águas utilizadas para o cultivo de ostras e o uso de um processo de depuração aliado ou não a um tratamento térmico são alternativas importantes para diminuição da contaminação microbiana dos moluscos bivalves, pois possibilitam um produto final mais seguro ao consumidor deste alimento. Procedimentos como estes devem ser levados em consideração quando se trata do consumo de ostras.

Com relação à caracterização das espécies, pelo método bioquímico, observou-se que de um total de 59 isolados de Aeromonas spp. obtidos das amostras de ostras, 35 (59,5%) foram confirmados como Aeromonas hydrophila e os demais, 24 (40,6%),  foram classificados como Aeromonas caviae. Quanto às amostras de água, de um total de 15 isolados de Aeromonas spp.  nove (60%) foram classificados como A. hydrophila e seis (40%) como A. caviae.

Pelo sequenciamento genético, confirmou-se a presença de Aeromonas sp e a espécie A. hydrophila, além da espécie A. media, não isolada pelo método convencional. A identificação de espécie diferente, como a A. media, reforça a importância do uso de ferramentas moleculares, como o sequenciamento genético, para a confirmação dos resultados dos testes bioquímicos, principalmente quando estes apresentam resultados inconclusivos.

O isolamento da espécie A. hydrophila, das amostras em estudo revela o grande risco do consumo de ostras provenientes de águas não tratadas e que não passam por processo de depuração, uma vez que esta espécie é reconhecida como patogênica para o ser humano, pois, segundo Pereira et al.¹⁸, esta espécie esta envolvida em casos de diarreia infantil, infecção hospitalar, ou gastrenterites causadas por ingestão de alimentos como ostras, mexilhões, pescados e vegetais. A presença de espécies de A. media nas amostras de ostra também pode oferecer risco aos consumidores. Essa espécie geralmente está envolvida em casos de diarréias agudas amenas e em quadros graves de disenteria

Corroborando com os achados desta pesquisa, ressaltam-se os trabalhos realizados por Mendes¹, identificando a espécie A. hydrophila em 77,78% das amostras de ostras, e por Pereira¹⁸ que isolou A. hydrophila em 15,50% das amostras de mexilhões na Baía de Guanabara.

Os resultados obtidos pela identificação molecular do gênero Aeromonas sugerem que podem existir falhas na identificação bioquímica desta bactéria, uma vez que os testes bioquímicos podem gerar resultados duvidosos^18,19e muitas vezes são incapazes de identificar com a devida precisão as espécies de Aeromonas face à homogeneidade fenotípica existente dentro deste gênero^18,20.

Os padrões de bandas encontrados neste estudo foram diferentes dos descritos por Borrell et al.⁹, não sendo possível, assim, a caracterização das espécies de Aeromonas  através do método de RFLP-PCR 16S rDNA.

Segundo Kozinska et al.²⁰ e Castro-Escarpulli et al.^22, diferenças na caracterização das espécies de bactérias do gênero Aeromonas foram identificadas quando os métodos bioquímicos e moleculares foram comparados por vários pesquisadores. O uso dos testes bioquímicos pode tornar-se difícil, principalmente devido à homogeneidade fenotípica das espécies do gênero Aeromonas²¹. Por outro lado, Graf ²³ relatou que, em algumas condições clínicas, os testes bioquímicos ainda devem ser usados, especialmente naqueles casos em que as técnicas moleculares geram resultados controversos, como no caso desta pesquisa, em que não foi possível a identificação das espécies de Aeromonas pelo método de RFLP-PCR 16S rDNA.

Resultados discrepantes entre estas duas técnicas também foram descritos por Ormen et al.²⁴ na identificação das espécies de Aeromonas em isolados clínicos e ambientais. Estes autores citam que os testes bioquímicos usam esquemas de identificação baseados em isolados clínicos e estes não podem ser aplicados por fornecerem incompleta identificação de isolados ambientais, além disso, a grande heterogeneidade genética das amostras ambientais pode influenciar nos resultados. Corroborando com esta afirmação, Huys et al.²⁵ demonstraram por métodos moleculares que há uma grande variação genética dos isolados de A. hydrophila, sugerindo a existência de uma subespécie. A grande variação genética dentro do gênero Aeromonas foi indicada também por Miñana-Galbis et al.²⁶, os quais identificaram a presença de uma nova espécie nos  isolados de moluscos bivalves. Utilizando a técnica de RFLP para identificação das espécies de Aeromonas, provenientes de várias fontes, Alperi et al.²⁷ verificaram que 8,1% das amostras apresentaram padrões de bandas diferentes, levando à identificação duvidosa destas amostras. Para esses autores a microheterogeneidade dos nucleotídeos destas espécies deve ser levada em consideração, quando se usam a RFLP ou outras técnicas moleculares.

Conforme mostra a literatura, a formação dos padrões de bandas diferentes encontradas neste estudo (Figura 2) pode ser resultado de um conjunto de causas, podendo estar principalmente relacionada à grande variação genética das bactérias do gênero Aeromonas, principalmente em amostras ambientais.

O uso de outros métodos moleculares associados à técnica da RFLP poderia aumentar o potencial discriminatório por detectar um número maior de polimorfismos, aumentando, assim, a confiança no resultado. Portanto, a combinação de mais de um método molecular para caracterização genética das Aeromonas sp. deve ser levada em consideração.

CONCLUSÃO

A identificação da espécie Aeromonas hydrophila nas amostras de ostras demonstra que este molusco pode oferecer risco à saúde dos consumidores e reforça a necessidade de atenção com a segurança microbiológica deste alimento. Enfatiza-se ainda que para a identificação das bactérias do gênero Aeromonas o uso de ferramentas moleculares, como o sequenciamento genético, torna-se importante, uma vez que resultados duvidosos podem ser obtidos na identificação bioquímica e a impossibilidade de identificação das espécies de Aeromonas pode ocorrer quando do uso da técnica de RFLP.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Estadual Paulista - UNESP (Campus de Jaboticabal), por permitir a realização dos estudos bioquímicos e moleculares desta pesquisa. Ao laboratório de Microbiologia de Alimentos e Água da Universidade Estadual do Maranhão – UEMA, onde foi realizada a primeira etapa da pesquisa.  À Fundação de Amparo à Pesquisa e Desenvolvimento Científico do Maranhão – FAPEMA, pela concessão de bolsa de mestrado, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

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Protocolado em: 18 fev. 2014. Aceito em: 02 set. 2014