DOI: 10.5216/cabv11i4.2449

EFEITO DE DIFERENTES PROTOCOLOS DE DESCONGELAÇÃO SOBRE O SÊMEN CANINO CRIOPRESERVADO EM DILUIDOR À BASE ÁGUA DE COCO EM PÓ (ACP-106®)

Victor Leão Hitzschky Madeira,¹ Cynthia Levi Baratta Monteiro,¹ Claudia da Cunha Barbosa,¹ Ricardo Parente Jucá,² Ângela Cristina de Oliveira,³ Daniel Couto Uchoa⁴ e Lúcia Daniel Machado da Silva⁵

1. Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias da Universidade Estadual do Ceará
2. Acadêmico da Medicina Veterinária da Universidade Estadual do Ceará
3. Médica veterinária autônoma
4. Doutorando do Programa de Pós-Graduação Rede Nordeste de Biotecnologia
5. Professor adjunto da Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará.
E-mail: lucia.daniel.machado@hotmail.com

RESUMO

Sabe-se que a temperatura, bem como a velocidade de descongelação do sêmen, pode afetar a qualidade deste. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi testar diferentes protocolos de descongelação para o sêmen canino diluído em ACP-106® e criopreservado. Para tanto, coletaram-se dez ejaculados oriundos de oito cães, sendo a fração espermática avaliada quanto ao volume, concentração, motilidade, vigor, pH, morfologia, integridade acrossomal e teste hiposmótico. Diluiu-se o sêmen em ACP-106®, contendo 20% de gema de ovo e 6% de glicerol, sendo congelado em palhetas de 0,25 mL. Depois de uma semana, a primeira palheta foi descongelada a uma temperatura de 37°C/60s, a segunda a 55°C/5s e a terceira a 75°C/8s e reavaliaram-se os parâmetros seminais. Os protocolos apresentaram resultados semelhantes para quase todos os parâmetros avaliados, com exceção da motilidade espermática, que foi melhor preservada na descongelação a 55°C/5s por até trinta minutos, seguida do protocolo de 37°C/60s e por último o de 75°C/8s. Analisando-se estes resultados, pode-se concluir que, para o sêmen canino congelado no diluidor ACP-106®, o melhor protocolo para descongelação foi o de 55C/5s.

PALAVRAS-CHAVES: ACP-106®, cão, criopreservação, descongelação, sêmen.




It is known that temperature and thawing velocity can affect sperm quality during freeze-thawing procedures. Thus, the aim of this research was to compare different thawing protocols for canine semen extended in ACP-106® extender and cryopreserved. Ten ejaculates were collected from eight dogs and sperm rich fraction was evaluated regarding volume, concentration, motility, vigor, pH, morphology, acrosomal integrity and hyposmotic swelling test. Then, semen was extended in ACP-106® with 20% egg yolk and 6% glycerol, and frozen in 0.25 mL straws. After one week, one straw was thawed at 37°C/60s, another one at 55°C/5s and a third one at 75°C/8s, and the seminal characteristics were reevaluated. Similar results were observed for all the groups, except for sperm motility which was better preserved at 55°C/5s for up 30min than at 37°C/60s or 75°C/8s. From these results, it is concluded that canine semen extended in ACP -106® is better thawed at 55°C/5s.

KEY WORDS: ACP-106®, cryopreservation, dog, semen, thawing.

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Atualmente o interesse por parte dos criadores de cães em usufruir dos benefícios das biotecnologias aplicadas à reprodução tem aumentado consideravelmente. No caso particular da criopreservação do sêmen, podem ser destacadas, como principais vantagens, o fato de que é possível armazenar o material genético de animais de alto valor zootécnico por um período ilimitado, transmitindo as características desses animais por várias gerações, mesmo após a morte do animal (SILVA et al., 2003). Apesar dessas vantagens, muitos pontos que aparentemente influenciam na sobrevivência e funcionalidade dos espermatozoides criopreservados permanecem não identificados, o que resulta em taxas de gestação altamente variáveis e geralmente mais baixas do que aquelas obtidas com sêmen fresco (LINDE-FORSBERG & FORSBERG, 1993).
A fim de melhorar estes resultados, vários pesquisadores vêm somando esforços no intuito de aperfeiçoar os protocolos de congelação do sêmen canino. Um exemplo disso é o desenvolvimento de diluidores alternativos que sejam atóxicos, isotônicos, tenham atividade tamponante, sejam de baixo custo, práticos e eficientes. O diluidor à base de água de coco tem em sua composição básica açúcares, proteínas, vitaminas, sais minerais, fatores de crescimento (fitormônios) e um baixo teor de fosfolipídeo. A sua formulação em pó (ACP_106®) foi testada para a refrigeração de sêmen equino (SAMPAIO-NETOet al., 2002), diluição para inseminação artificial em caprinos (SALGUEIRO et al., 2002), refrigeração (MADEIRA et al., 2003) e congelação de sêmen canino (CARDOSO et al., 2005), apresentando bons resultados.
Outro ponto de extrema importância para a melhoria dos resultados na congelação do sêmen é a metodologia empregada na descongelação. Investigações recentes têm levado à hipótese de que os espermatozoides criopreservados são danificados, principalmente, durante a descongelação (GAO et al., 1992; HOLT et al., 1992; CURRY & WATSON, 1994; HOLT & NORTH, 1994). Por razões práticas, o sêmen canino é frequentemente descongelado a 37ºC/1-3 minutos, embora vários pesquisadores tenham verificado que a descongelação a temperaturas maiores melhore a viabilidade dos espermatozoides (ENGLAND & ALLEN, 1992).
Em trabalhos para comparação da temperatura e do tempo de descongelação sobre a qualidade espermática canina, observou-se que a temperatura de descongelação mais alta por um menor tempo promoveu uma melhor qualidade pós-descongelação (IVANOVA-KICHEVA et al., 1995; PEÑA & LINDE-FORSBERG, 2000). No entanto, SILVA et al. (1998), trabalhando com cães, e MINTER & DeLIBERTO (2005), com coiotes, observaram uma melhor qualidade espermática pós-descongelação em temperaturas mais baixas e por maior tempo. NÖTHLING et al. (2007) constataram que a descongelação do sêmen canino a 98°C por 6,5s não trouxe benefícios, comparada à de 70°C por 8s. CHIRINÉA et al. (2006) utilizaram um método de descongelação a 75ºC por 8s para o sêmen de cães e obtiveram excelente qualidade espermática. NÖTHLING & SHUTTLEWORTH (2005), além de verificarem o protocolo de descongelação, relacionaram o tamanho da palheta e observaram que as amostras congeladas em palhetas de 0,5 mL foram as que apresentaram os melhores resultados pós-descongelação.
Diante do exposto, percebe-se que ainda existem muitas variações no que diz respeito ao melhor protocolo de descongelação. Além disso, nenhum trabalho propôs o melhor protocolo de descongelação quando se usa ACP-106® como diluidor. Sendo assim, objetivou-se com este trabalho avaliar o efeito de diferentes protocolos de descongelação sobre a qualidade do sêmen canino criopreservado com um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®).


Local de execução
O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução de Carnívoros localizado na cidade de Fortaleza, CE, Brasil.

Animais experimentais
Foram utilizados oito cães, oriundos de canis particulares, sendo dois da raça Boxer, um da raça Retriever do Labrador, um da raça Rottweiler, um da raça Cane Corso, um da raça Bullmastif, um da raça American Pit Bull Terrier e um da raça Whippet com idades entre dois e nove anos. Os cães, mantidos em canis individuais, receberam alimentação à base de ração comercial peletizada uma vez por dia e tiveram acesso à água ad libitum.

Coleta do sêmen
O sêmen foi coletado por meio da técnica de manipulação digital do bulbo peniano com o auxílio de um funil de plástico e tubos de vidro graduados. Como no cão a ejaculação ocorre de forma fracionada, fez-se a separação do sêmen em suas três frações distintas, sendo a primeira e a terceira de origem prostática desprezadas e a segunda, denominada fração espermática, de origem testicular e rica em espermatozoides retida para fins de avaliação e posterior criopreservação (SILVA et al., 2003). No total, coletaram-se e processaram-se dez ejaculados, sendo que os cães das raças Retriever do Labrador e Cane Corso foram coletados por duas vezes.

Avaliação do sêmen
A segunda fração do sêmen coletada foi avaliada macro e microscopicamente. As avaliações macroscópicas incluíram cor, volume e pH. Já as microscópicas incluíram motilidade (porcentagem de espermatozoides móveis 0-100%), vigor (qualidade da motilidade), que foi avaliado em uma escala variando de 0 (sem movimento) a 5 (movimento retilíneo progressivo), concentração e morfologia espermáticas, bem como a integridade acrossomal (PLATZ & SEAGER, 1977).
Avaliaram-se a cor e o volume apenas no sêmen fresco. O pH, a morfologia espermática e a integridade do acrossoma foram avaliados no sêmen fresco e congelado/descongelado.
As avaliações de motilidade e vigor foram rea­lizadas com o auxílio da microscopia óptica (M.O.), no aumento de 100x. Verificou-se a concentração espermática em câmara de Neubauer, utilizando-se uma diluição de 5 μL de sêmen para 1 mL de solução salina formolizada (CARDOSO et al., 1997).
Para a avaliação da morfologia e integridade acrossomal, realizaram-se preparações úmidas, as quais foram coradas com Rosa de Bengala e, posteriormente, avaliadas utilizando-se um microscópio óptico (1000x), fazendo-se a contagem de duzentas células espermáticas. No tocante à morfologia, classificaram-se os espermatozoides como normais ou apresentando alterações morfológicas primárias ou secundárias, sendo separadas de acordo com a sua localização e o acrossoma classificado como normal ou danificado (SILVA et al., 2009).

Teste hiposmótico
Realizou-se o teste hiposmótico (HOS) após a coleta e imediatamente após a descongelação do sêmen, tendo como função avaliar a integridade funcional da membrana espermática (SPITTALER & TYLER, 1985). Para isso, 0,01 mL de sêmen foi diluído em 0,09 mL de água destilada e mantido em banho-maria a 38 ºC. Após 45 minutos, os espermatozoides de cada alíquota foram colocados em uma lâmina e avaliados em microscópio óptico. contaram-se duzentas células em aumento de 400x, sendo os espermatozoides que apresentavam sua cauda enrolada considerados como tendo a membrana espermática funcional.

Teste de termorresistência
O teste de termorresistência foi realizado após a descongelação do sêmen, sendo este mantido em banho-maria a 38 ºC. Avaliaram-se a motilidade e o vigor espermático imediatamente após a descongelação e aos trinta, sessenta, noventa e 120 minutos.

Preparo do diluidor
Utilizou-se um diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106®), preparado de acordo com a orientação do fabricante. O diluidor continha 20% de gema de ovo e 6% de glicerol (concentração final no diluidor).

Processamento do sêmen
O sêmen foi processado conforme descrito por CARDOSO et al. (2003). O volume total de diluidor a ser acrescido ao sêmen foi dividido em duas partes (A e B), sendo a parte A composta apenas pelo ACP-106® acrescido de gema de ovo e a parte B, similar à anterior, mas contendo 12% de glicerol.
O sêmen foi diluído inicialmente com metade do volume de diluidor necessário para a obtenção da concentração final de 200 x 106 espermatozoides/mL. Nesta etapa, utilizou-se somente a parte A do diluidor. Após esta diluição inicial em temperatura ambiente (aproximadamente 27°C), as amostras foram armazenadas em tubos de vidro e estes colocados em um recipiente com água e acondicionados em caixa térmica plástica de 3 L, medindo 14 cm de largura, 21 cm de comprimento e 15 cm de altura com gelo reciclável (15°C) por quarenta minutos. Após este período, transferiu-se o sêmen para um refrigerador até atingir 4°C, o que demorou trinta minutos e, posteriormente, adicionou-se a parte B ao sêmen. O sêmen foi envasado em palhetas de 0,25 mL, sendo estas dispostas horizontalmente em rampa de congelação a uma altura de 5 cm do nível de nitrogênio líquido por cinco minutos e, finalmente, armazenadas em nitrogênio líquido. Após uma semana, as amostras foram descongeladas em banho-maria, sendo a primeira palheta descongelada a 37°C/60s, a segunda a 55°/5s e a terceira a 75°C por 8s e avaliadas microscopicamente.

Análise estatística
Avaliaram-se as características macroscópicas do sêmen fresco de forma subjetiva, exceto o volume da fração espermática, que, juntamente com as características microscópicas, foi submetido à estatística descritiva e expresso na forma de média e desvio-padrão. A análise dos dados foi realizada pelo programa Systat 7.0 (SPSS Inc. 1997). Os dados percentuais sofreram transformação angular arco seno. Para verificar as diferenças estatísticas entre os protocolos com relação à motilidade, vigor, morfologia, integridade acrossomal e porcentagem de caudas enroladas, utilizou-se ANOVA-GLM (General Linear Model) e nos casos em que houve diferenças estatísticas, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey, para se verificar onde ocorreram as diferenças. Para todas as análises utilizou-se P < 0,05.


No tocante ao sêmen fresco, observou-se que todos os ejaculados apresentaram-se de cor branco opalescente e viscosidade leitosa e que os demais parâmetros (macro e microscópicos) encontravam-se dentro da normalidade (Tabela 1), como descrito por SILVA et al. (2003).
A motilidade espermática do sêmen descongelado a 55°C/5s (58,50 ± 14,92%) foi melhor do que no descongelado a 37°C/60s (46,00 ± 11,74%), que, por sua vez, foi melhor do que a 75°C/8s (19,60 ± 29,31%) nos tempos zero e trinta minutos. O sêmen fresco foi o que apresentou o melhor resultado de motilidade (P < 0,05 – Tabela 2). A partir de sessenta minutos, não houve mais diferença entre a motilidade nos três protocolos de descongelação testados (P > 0,05 – Tabela 2). Quando se compara a motilidade dentro de cada grupo ao longo do tempo, observa-se que, nos protocolos de descongelação 37°C/60s e 55°C/5s, no tempo 0 min, ela foi superior a todos os outros tempos, e no tempo de trinta minutos foi superior aos tempos de sessenta, noventa e 120 minutos (P < 0,05) e a partir dos sessenta minutos não houve mais diferenças (P > 0,05). Para as amostras descongeladas a 75°C/8s, a motilidade não diferiu das demais em momento algum (P > 0,05 - Tabela 2).
Com relação ao vigor espermático do sêmen descongelado, este não diferiu nos protocolos de 37°C/60s e 55°C/5s em todos os tempos avaliados, mas ambos apresentaram resultados melhores que o protocolo 75°C/8s nos tempos zero e trinta minutos (P < 0,05). No que diz respeito à comparação dos protocolos entre os tempos, o vigor se manteve inalterado até trinta minutos. A partir de sessenta minutos, houve uma redução significativa no vigor, que se manteve estável até 120 minutos (Tabela 3).
Para as características morfológicas dos espermatozoides, não houve diferenças entre as alterações primárias de cabeça, peça intermediária e de cauda e secundárias de peça intermediária entre nenhum dos protocolos e em relação ao sêmen fresco (P > 0,05). Já com relação às alterações secundárias de cabeça e cauda, observaram-se algumas diferenças. No caso das alterações secundárias de cabeça, os protocolos 37°C/60s e 75°C/8s foram semelhantes entre si (P > 0,05) e apresentaram um aumento nas alterações morfológicas quando comparados ao sêmen fresco (P < 0,05), ao passo que o protocolo 55°C/5s não diferiu do sêmen fresco, nem dos demais protocolos (P > 0,05). Com relação às alterações secundárias de cauda, todos os protocolos foram semelhantes entre si e apresentaram mais alterações que o sêmen fresco (Tabela 4)
Neste estudo, observou-se que não houve diferenças com relação à porcentagem de acrossomas intactos entre os protocolos, mas todos apresentaram uma porcentagem menor de acrossomas intactos em relação ao sêmen fresco (Figura 1).
Houve uma redução significativa no percentual de células que foram reativas ao teste hiposmótico em todos os protocolos com relação ao sêmen fresco, não diferindo entre os protocolos após a descongelação (Figura 2).
Não houve alteração do pH nos protocolos de 37°C/60s e 55°C/5s (P > 0,05), no entanto, houve uma redução do pH no protocolo de 75°C/8s em relação ao sêmen fresco (P < 0,05) (Figura 3).


De acordo com a análise dos resultados do sêmen fresco, observou-se que as amostras estavam aptas a participarem do experimento, visto que todos os parâmetros avaliados apresentavam-se dentro da normalidade para a espécie canina, conforme descrito por SILVA et al. (2003).
Com relação à motilidade pós-descongelação, este estudo demonstrou que existe uma diferença significativa entre os três protocolos de descongelação, sendo que o de 55°C/5s apresentou os melhores resultados por até trinta minutos após a descongelação, seguido pelo de 37°C/60s e, por último, o protocolo 75°C/8s. Resultado semelhante foi obtido por IVANOVA-KICHEVA et al. (1995), que obtiveram uma melhor motilidade quando descongelaram o sêmen de cães a 55°C/5s em comparação com a descongelação a 37°C/8s. Segundo IVANOVA-KICHEVA et al. (1995), descongelar o sêmen em temperaturas mais altas reduz os efeitos destrutivos dos processos osmóticos nas estruturas dos espermatozoides. Além disso, o aumento rápido da temperatura de -196°C a 55°C por 5s impede a recristalização intracelular, o que provavelmente favoreceu o protocolo 55°C/5s em relação ao protocolo 37°C/60s. Embora tenha havido uma superioridade estatisticamente significativa da motilidade do protocolo 55°C/5s em relação ao 37°C/60s, percebe-se que ambos os protocolos apresentaram uma motilidade dentro da faixa aceitável para a realização de inseminações artificiais, levando-se em consideração os dados de THOMASSEN et al. (2006), que sugerem, para a espécie canina, a motilidade pós-descongelação acima de 50% como ideal e acima de 30% como aceitável, visto que é necessário um número adequado de espermatozoides móveis para que estes possam chegar até o oviduto e realizar a fecundação.
NÖTHLING & SHUTTLLEWORTH (2005) relacionaram o tamanho da palheta com o protocolo de descongelação e observaram que as amostras congeladas em palhetas de 0,5 mL e descongeladas a 70°C por 8s foram as que apresentaram os melhores resultados. PEÑA & LINDE-FORSBERG (2000) observaram que todos os parâmetros avaliados foram significativamente melhores quando se descongelaram os espermatozoides a 70ºC por 8s quando comparados com 37ºC por 15s. CHIRINÉA et al. (2006) utilizaram um método de descongelação a 75ºC por 8s para o sêmen de cães e obtiveram excelente qualidade espermática pós-descongelação. Percebe-se que todos esses pesquisadores conseguiram bons resultados na descongelação do sêmen a altas temperaturas e todos eles atribuem a esses bons resultados a mesma justificativa de IVANOVA-KICHEVA et al. (1995). Contudo, nesses experimentos, diferentemente deste, o sêmen foi envasado em palhetas de 0,5 mL. Diante disso, é possível que a influência letal das altas temperaturas sobre a viabilidade dos espermatozoides seja maior sobre palhetas de 0,25 mL em relação a palhetas de 0,5 mL, pois o conteúdo da palheta de 0,25 mL descongelaria mais rapidamente que o da palheta de 0,5 mL e, sendo assim, o sêmen descongelado da palheta de 0,25 mL permaneceria por mais tempo a uma temperatura elevada. A partir do que foi exposto, acredita-se que o resultado obtido na descongelação a 75°C/8s poderia ser melhorado caso fosse usada uma palheta de 0,5 mL ou então fosse diminuído o tempo de exposição à temperatura de 75°C. Outro ponto importante é que nenhum destes autores utilizou a água de coco como diluidor e, diante disso, é possível que a redistribuição do calor durante a descongelação e a proteção dos espermatozoides durante este processo sejam diferentes para o diluidor à base de água de coco em pó.
Com relação ao vigor espermático, não houve diferença entre os protocolos 55°C/5s e 37°C/60s e novamente o pior protocolo de descongelação foi o de 75°C/8s, sendo a provável causa, para isso, o efeito deletério da alta temperatura.
No tocante às alterações morfológicas, acrossomas intactos e caudas enroladas, após o teste hiposmótico não se verificaram diferenças entre os protocolos, mostrando que não houve efeito diferenciado da temperatura e do tempo de congelação sobre essas características seminais. Observaram-se um maior percentual de alterações totais e secundárias da cabeça e cauda e uma diminuição de acrossomas intactos e caudas reativas ao teste hiposmótico em relação ao sêmen fresco, indicando que, provavelmente, o efeito de redução da qualidade seminal pós-descongelação deveu-se ao processo de congelação.
Com relação ao pH, constatou-se que a ação tamponante do diluidor foi extremamente eficaz, dada a capacidade de manter o pH dentro da normalidade ao longo de todo experimento (CHRISTHIANSEN, 1988).


A partir dos resultados obtidos, sugere-se que o melhor protocolo de descongelação para o sêmen de cães utilizando como diluidor o ACP-106® é 55°C/5s, já que este proporcionou uma melhor motilidade por até trinta minutos após a descongelação.


À CAPES, ao CNPq e à FUNCAP, pelo apoio financeiro; aos proprietários dos cães, em particular ao Daniel Couto Uchoa, por disponibilizar os animais para o estudo; ao Prof. Dr. Airton Alencar de Araújo, pela colaboração nas análises estatísticas, e ao Laboratório de Tecnologia do Sêmen Caprino, pela disponibilização de uso do CASA.

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Protocolado em: 22 nov. 2007.    Aceito em: 21 set. 2010.