2264v10n4

Vibrio spp. ISOLADOS DE CAMARÃO E ÁGUA DE CULTIVO DE FAZENDA MARINHA EM PERNAMBUCO

Emiko Shinozaki Mendes,¹ Simone Francisca Lira,² Lílian Maria Nery de Barros Góes,³
Joanna Dourado,⁴ Paulo de Paula Mendes⁵ e Carlos André Bezerra Alves⁴

1. Professora adjunto, Laboratório de Sanidade de Animais Aquáticos, Departamento de Medicina Veterinária, UFRPE, E-mail: esmendes@dmv.ufrpe.br
2. Graduação em Medicina Veterinária, UFRPE
3. Pós-Graduação em Ciência Veterinária (Doutorado), UFRPE
4. Pós-Graduação em Ciência Veterinária (Mestrado), UFRPE
5. Professor associado, Departamento de Pesca e Aquicultura, UFRPE.

RESUMO

Coletaram-se, mensalmente, amostras de água e camarão, durante todas as fases de cultivo, em três fazendas situadas no litoral de Pernambuco, no período de estio e chuvoso, para a quantificação e identificação de spp., totalizando noventa amostras. As contagens foram correlacionadas, através de modelos matemáticos (P<0,05), com as variáveis estação do ano, parâmetros bioquímicos da água, exame a fresco, exame histopatológico, presença de toxinas e técnicas de manejo empregadas. Apenas a variável tempo de cultivo interferiu na contagem total de VibrioVibrio spp. em todas as amostras. Obtiveram-se contagens que variaram de 0,1x 10 a 6,2 x 10³ UFC/mL na água, de 7,0 x 10 a 8,2 x 10⁵ UFC/g na pós-larva, de 1,1 x 10 a 1,1 x 10⁵ UFC/mL na hemolinfa e de 2,5 x 10² a 1,1 x 10⁶UFC/g no hepatopâncreas. Identificaram-se as espécies V. mediterranei (1%), V. mimicus (1,25%), V. fischeri (4,25%), V. cincinnatiensis (4,25%), V. metschnikovii (4,25%), (5,5%), V. proteolyticusV. harveyi (5,5%), V. hollisae (5,5%), V. carchariae (7%), V. vulnificus (8,5%), V. damsela (8,5%), V. parahaemolyticus (13%), V. fluvialis (15%), V. anguillarum (16,5%). Conclui-se que a carga microbiana aumenta proporcionalmente com tempo de cultivo, em virtude do incremento de matéria orgânica, o que pode tornar os animais suscetíveis à infecção por víbrios.

PALAVRAS-CHAVES: Água de cultivo, Vibrio spp., camarão e Vibrionaceae.

ABSTRACT

Vibrio spp. ISOLATED FROM SHRIMPS AND WATER FROM A MARINE FARM IN PERNAMBUCO, BRAZIL

Water and shrimp samples were collected monthly, during all cultivation phases, in three located farms at Pernambuco coast, on winter and summer, for Vibrio spp. quantification and identification. The counting’s were correlated, through mathematical models (P<0.05), with the variables season, water biochemical parameters, wet mount, histopathology exam, toxins presence and handling techniques used. Just the variable cultivation time interfered at total counting of Vibrio spp. in all samples were obtained countings that varied 0.1x 10 to 6.2 x 10³ UFC/mL in water, of 7.0 x 10 to 8.2 x 105 UFC/g in powder-larva, of 1.1 x 10 to 1.1 x 10⁵ UFC/mL in hemolymph and of 2.5 x 10² to 1.1 x 106UFC/g in hepatopancreas. The species V. mediterranei (1%), V. mimicus (1.25%), V. fischeri (4.25%), V. cincinnatiensis (4.25%), V. metschnikovii (4.25%), (5.5%), V. proteolyticusV. harveyi (5.5%), V. hollisae (5.5%), V. carchariae (7%), V. vulnificus (8.5%), V. damsela (8.5%), V. parahaemolyticus (13%), V. fluvialis (15%), V. anguillarum (16.5%) were identified. It is concluded that the Vibrionaceae load increases proportionally with cultivation time, due to the organic matter increment, what can turn the susceptible animals to the infection for vibrios.

KEY WORD: Vibrionaceae, Vibrio spp., shrimp and pond water.

INTRODUÇÃO

A carcinicultura é uma atividade da aquicultura na qual o Brasil se destaca mundialmente, como um dos mais promissores produtores de camarão-marinho (ROCHA & RODRIGUES, 2003). Todavia, com a expansão dos cultivos cresceram também os problemas com a produção, fato relatado por MENDES et al. (2005), quando alertaram que as altas densidades de estocagem praticadas podem comprometer os cultivos e exigem cuidados especiais, principalmente no que se refere à sanidade dos animais. ROMERO et al. (2003) reforçaram que a intensificação da produção aquicola pode ter como consequência o desenvolvimento de problemas ecológicos e patológicos.
Nesse contexto, um manejo sanitário eficiente é de extrema importância, devendo ser realizado se conhecendo e considerando a inter-relação existente entre o hospedeiro, o ambiente e o patógeno, estando estes três componentes dependentes entre si. De acordo com GALLI (2004), qualquer alteração no equilíbrio a favor de algum deles pode determinar o aparecimento de uma enfermidade, ou seja, variações ambientais podem afetar tanto o hospedeiro quanto o patógeno. Por isso, é importante o conhecimento do estado de saúde dos animais na área de cultivo, baseado em inspeções e padronização de procedimentos de amostragem, seguidas de diagnóstico laboratorial de acordo com as normas internacionais (MACIEL et al., 2003).
As doenças que acometem os camarões-marinhos cultivados são de etiologias diversas, podendo ser ocasionadas tanto por agentes biológicos como por não biológicos (COUCH, 1978; BELL & LIGHTNER, 1987; JOHNSON, 1989; LIGHTNER, 1997). Dentre as doenças causadas por agentes biológicos, as mais comuns são as ocasionadas por microrganismos oportunistas encontrados na água e sedimento, podendo também fazer parte da microbiota intestinal de muitas espécies aquáticas, inclusive do camarão. Dos microrganismos predominantes no intestino de camarões-marinhos destacam-se os do gênero Vibrio (LIGHTNER, 1983; THOMPSON et al., 2004; KUMAR et al., 2007).
Doenças causadas por Vibrio spp. têm muita importância para a carcinicultura, porque se trata de bactérias que são capazes de afetar todos os estádios de vida do camarão e em larvicultura pode significar 100% de perda dos animais afetados. Além dos prejuízos ocasionados à exploração de camarões em cativeiro, a questão de algumas espécies de víbrios serem agentes zoonóticos, fontes de infecções alimentares para o homem quando o alimento é ingerido cru ou mal cozido, é de extrema importância para saúde pública. Historicamente, a vibriose em camarões cultivados está associada com fatores adicionais que predispõem o animal à infecção. Os principais fatores incluem manejo, ferimentos na cutícula e carapaça, infecções prévias por outros patógenos incluindo vírus, rickettsia, Fusarium spp, Gregarina spp., danos do tecido intestinal por algas tóxicas, deficiência de vitamina C, estresse fisiológico químico ou físico (PEREIRA, 2002).
De acordo com JAYASREE et al. (2006), os víbrios podem causar cinco tipos de enfermidades em camarão Penaeus monodon (necrose da cauda, doença da carapaça, doença vermelha, síndrome da carapaça solta e doença do intestino branco), que estão principalmente associadas com seis espécies de Vibrio: V. harveyi, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. anguillarum, V. vulnificus e V. splendidus.
A preocupação com as enfermidades, incluindo a vibriose, tem sido uma constante para os produtores, devido às muitas questões não esclarecidas a respeito da etiologia de algumas patologias. Além disso, é importante destacar que essa atividade é relativamente recente, quando comparada aos demais setores da aquicultura. A criação de camarão é uma atividade bastante exigente, porém as práticas de manejo adotadas são extremamente variáveis entre as propriedades, acarretando, muitas vezes, manejos inadequados.
Dada a importância da vibriose, objetivou-se avaliar a qualidade microbiológica da água e do camarão provenientes de carciniculturas localizadas no litoral de estado de Pernambuco, no tocante à contagem e identificação de Vibrio spp.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi realizado no período de outubro de 2005 a novembro de 2006. Coletaram-se as amostras em três fazendas comerciais (A, B e C) do litoral norte e sul do estado de Pernambuco. Foram escolhidos aleatoriamente dois viveiros em cada propriedade para o acompanhamento de dois ciclos de produções seguidos. Realizaram-se as análises laboratoriais no Laboratório de Sanidade de Animais Aquáticos (LASAq) do Departamento de Medicina Veterinária (DMV) da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE).
Coletaram-se trinta amostras, sendo quinze de água e quinze de camarão de dois viveiros em cada fazenda, totalizando noventa amostras, sendo a primeira coleta realizada no dia do povoamento do viveiro (transferência dos camarões do berçário para o viveiro), seguida de coletas mensais, até o término do cultivo em viveiro de terra (média de 90 a 120 dias), nos períodos de estio e de chuva. As amostras de água foram envasadas (em recipientes esterilizados) e acondicionadas em caixas isotérmicas e os camarões foram transportados vivos em sacos de polietileno apropriados contendo água do viveiro sob aeração constante, sendo imediatamente transportados para o LASAq.
Isolaram-se os microrganismos do gênero Vibrio a partir de amostras de água, camarão (até 3ª coleta), hepatopâncreas e hemolinfa (a partir da 4ª coleta). Utilizou-se o método de plaqueamento de superfície (SILVA et al., 2000) para as amostras de água e hemolinfa, que foram diluídas, e as de camarão e hepatopâncreas foram trituradas e diluídas, em tubos contendo água peptonada alcalina. Em seguida, transferiram-se alíquotas de 0,1 mL para o placas de Petri contendo ágar tiossulfato citrato sais de bile (TCBS), sendo invertidas e incubadas a 35-37°C por 18-24 horas.
Foram contadas e repicadas colônias características no ágar TCBS, para o Tryptone Soya Agar (TSA) suplementado com 2,0% de cloreto de sódio para estoque dos isolados. A seguir, realizou-se o estudo do perfil bioquímico das colônias: halofilismo a 0, 1, 3, 6, 8 e 10% de NaCl, produção de citocromo-oxidase, produção de acetoína em meio de Voges Proskauer (VP), descarboxilação de lisina-ornitina e dehidrolação de arginina, produção de urease em meio caldo ureia de Christensen, produção da enzima gelatinase e produção de ácido a partir de sacarose, celobiose, lactose, arabinose, manose e manitol conforme a orientação de FDA (2001) e BULLER (2004).
Para as informações obtidas e análises realizadas, empregaram-se as técnicas de modelagem matemáticas. Portanto, o modelo linear foi proposto, inicialmente, de acordo com a seguinte formulação:
Prob = β0 + β1 CVcam + β2 CVa + β3 TC + β4 Faz + β5 Ma + ei;
em que: Prob – probabilidade de ocorrência da enfermidade (vibriose sistêmica ou cuticular); β0 e β5 – parâmetros do modelo; CVcam – carga de víbrio no camarão; CVa – carga de víbrio na água; TC – tempo de cultivo; Faz – fazenda; Ma – manejo; ei – erro associado a cada observação.

Para estimar os parâmetros dos referidos modelos, foram utilizadas as técnicas matriciais, e para selecionar as variáveis significativas (P < 0,05) incluídas no modelo, o processo de Stepwise Forward. Associado ao processo de Stepwise, empregou-se o transformador “λ” (BOX & COX, 1964), modelo simplificado, para minimizar a variância experimental. Para a realização dos cálculos, utilizou-se o pacote Estatístico SysEapro.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Em animais de todas as fazendas foi constatada a presença de bactérias do gênero Vibrio, tanto no período de estio como no de chuva, conforme apresentado na Tabela 1 e Tabela 2. Na fazenda C, no período de estio, detectaram-se as menores contagens para Vibrio spp. na água do viveiro 1 (V1), cujo valor máximo foi de 4,6 x 10 UFC/mL, sendo o baixo índice mantido no período das chuvas. No entanto, o número de víbrios nos camarões foi maior nos da fazenda C, obtendo-se 2,7 x 10⁵ UFC/g no V1 no período de estio e de 8,2 x 10⁵ UFC/g no período das chuvas no V2.
É importante atentar para a relação entre a carga bacteriana detectada na água e no camarão, pois não necessariamente a menor contagem de Vibrio spp. encontrada em água estará relacionada com a menor contagem encontrada nos animais, pelo fato de a água ser um elemento constantemente renovável no cultivo, o que não ocorre com os animais. Ao analisar microbiologicamente ostras consumidas na grande Recife, MENDES (2001) relatou que não existe uma real simultaneidade entre a amostra de água e a de bivalve, pois a massa d’água no momento da coleta não corresponde às que sucederam antes. Resultados semelhantes também foram obtidos por CERUTTI & BARBOSA (1991), ao pesquisarem a flora bacteriana heterotrófica em ostras (Crassostera rhizophorae) e águas da Bahia Norte, Ilha de Santa Catarina.
Em relação à contagem de Vibrio spp. no hepatopâncreas dos camarões, foram observados os maiores valores nos animais do V2 da fazenda A (1,1 x 10⁶ UFC/g), no período de estio, sendo no período das chuvas também detectada a maior contaminação nos camarões da fazenda A, no V1 (1,6 x 10⁵ UFC/g).
Nas fazendas A e B, obtiveram-se as maiores contagens de Vibrio spp. na hemolinfa dos camarões oriundos do V2 da fazenda A (1,0 x 10⁵ UFC/mL) e do V2 da fazenda B (1,2 x 10³ UFC/mL), no período de estio e chuvoso, respectivamente. Ressalta-se que MENDES et al. (2005) alertaram que a hemolinfa deve ser estéril, sendo a presença de bactérias indício de infecção sistêmica.
Ressalta-se ainda que as medidas contra a vibriose são tomadas, na maioria das vezes, como respostas emergenciais, levando ao uso indiscriminado de antibióticos, dificultando a análise e o diagnóstico das doenças, o que ocasiona o desenvolvimento de bactérias resistentes. Os víbrios são patogênicos aos seres humanos, acarretando variados distúrbios na saúde, que podem ir desde uma diarreia autolimitante a casos de óbito por septice (RIBEIRO, 2005).
Na análise da correlação da variável dependente ocorrência de enfermidade (vibriose sistêmica ou cuticular) com as variáveis independentes fazendas (A, B e C), tempo de cultivo, viveiro (1 e 2), estação do ano, quantidade de víbrio na água e quantidade de víbrio no camarão, obteve-se a seguinte função matemática
ENF = 0,2617 + 0,0098tc
R2 = 0,2422,
em que: ENF – ocorrência da enfermidade; tc – tempo de cultivo.
Com base no valor encontrado para o índice determinístico, que foi de R2 = 0,2422, pode-se afirmar que a variável resposta é explicada em 24,22% pela variável tempo de cultivo (tc). É importante atentar que o presente experimento foi realizado a campo e que não houve, por parte dos pesquisadores, controle de variáveis como manejo e variações climáticas. Por isso, apesar de aparentemente pouco expressivo, o índice determinístico é estatisticamente significativo.
O coeficiente da variável tempo de cultivo positivo indica que, quanto maior o tempo de cultivo, maior é a probabilidade de ocorrer enfermidade nos animais. O fato de não terem sido inseridas, no modelo, as variáveis carga de víbrio na água e carga de víbrio no camarão implica a afirmação de que a ocorrência da enfermidade é independente da carga microbiana. Provavelmente, apenas a presença da bactéria no organismo do animal, provocando a infecção sem sintomas aparentes, torna o animal vulnerável a adoecer. A enfermidade (sistêmica e/ou cuticular) poderá ocorrer quando as condições de cultivo se tornarem desconfortáveis para o animal, como se espera que aconteça com o aumento do tempo de cultivo. As variáveis manejo e fazenda também não foram significativas.
Em relação à identificação de víbrios, na fazenda A, no período de estio, foram identificadas as seguintes espécies: V. cincinnatiensis (1,25%), V. hollisae (1,25%), V. carchariae (1,25%), V. anguillarum (7%) e V. fluvialis (7%). No período chuvoso foram identificados os V. parahaemolyticus (1,25%), V. proteolyticus (1,25%), V. vulnifcus (2,5%), V. harveyi (2,5%), V. hollisae (2,5%), V. damsela (3,75%) e V. fluvialis (7%) (Tabela 3).
Na fazenda B no período de estio, foram encontrados V. harveyi (1,25%), V. mediterranei (1,25%), V. cincinnatiensis (1,25%), V. damsela (1,25%), V. fischeri (1,25%), V. proteolyticus (1,25%), V. parahaemolyticus (2,5%), V. vulnificus (2,5%), V. carchariae (3,75%) e V. anguillarum (3,75%). No período chuvoso evidenciou-se apenas a presença dos V. harveyi (1,25%), V. fluvialis (1,25%), V. damsela (1,25%), V. fisheri (1,25%), V. anguillarum (1,25%), V. vulnificus (2,5%) e V. parahaemolyticus (5%), Não se detectaram V. cincinnatiensis, V. proteolyticus, V. carchariae e V. mediterranei.
Com relação à fazenda C, foram identificados V. carchariae (1,25%), V. mimicus (1,25%), V. proteolyticus (1,25%), V. ficheri (1,25%), V. vulnificus (1,25%), V. anguillarum (3,75%) e V. metschnikovii (3,75%). Contudo, no período chuvoso, além do V. proteolyticus (1,25%), foi evidenciada a presença de V. cincinnatiensis (1,25%), V. hollisae (1,25%), V. damsela (1,25%) e V. parahaemolyticus (2,5%). É importante ressaltar que, ao se comparar a diversidade de Vibrio spp., foi observada maior diversidade de espécies no período de estio para as fazendas B e C, e no período chuvoso para a fazenda A (Tabela 3).
Deve-se ressaltar que a variabilidade de espécies e de carga de microrganismos dificulta maiores discussões a respeito do assunto, uma vez que poucos estudos têm retratado a diversidade de vibrionáceas em água e camarões de cultivo no nordeste brasileiro, como os de ALVES (2007) e SILVA (2007), o que demonstra a necessidade de maiores pesquisas sobre o assunto na área.
MENDES et al. (2005) ressaltaram que Vibrio anguillarum, V. alginolyticus, V. cholerae, V. damsela, V. harveyi, V. splendidus, V. vulnificus e V. parahaemolyticus são as bactérias marinhas identificadas em epidemias bacterianas de camarão-marinho, ocasionando infecções entéricas, sistêmicas ou externas. Também ALVES (2007) detectou, em águas de viveiro e em camarões marinhos cultivados no litoral norte de Pernambuco, espécies de víbrios ambientais (V. carchariae, V. mimicus, V. proteolyticus, V. metschnikovii, V. halioticoli e V. mediterranei) e patogênicas (Vibrio anguillarum e V. vulnificus) para peneídeos.
SILVA (2007) identificou V. damsela (5%), V. anguillarum (20%), V. mediterranei (5%), V. proteolyticus (3,3%), V. fluvialis (15%), V. halioticoli (3,3%), V. harveyi (3,3%), V. carchariae (8%), V. alginolyticus (3,3%), V. fischeri (5%), V. hollisae (3,3%), V. vulnificus (8,3%), V. furnissii (1,7%), V. parahaemolyticus (5%) e V. cincinnatiensis (5%), em amostras de água e camarões cultivados no litoral sul de Pernambuco. Detectou ainda a tendência ao aumento na carga de vibrionáceas em função do tempo de cultivo para todas as amostras analisadas. Destaca-se que, no presente estudo, apenas o V. furnissii não foi identificado.
JAYASREE et al. (2008) isolaram Vibrio harveyi, V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. splendidus e V. vulnificus da hemolinfa de camarão, com a predominância do Vibrio harveyi em todas as amostras. Histopatologicamente verificaram lesões típicas de septicemia bacteriana, com a invasão de bactérias na hemolinfa, formação de granulomas no hepatopâncreas e extensiva proliferação no tecido conectivo e necrose do hepatopâncreas, brânquias e tecido ovariano.
A detecção de bactérias de importância para a saúde pública como Vibrio vulnificus e V. parahaemolyticus em todas as fazendas endossa a necessidade de maior controle dos cultivos, assim como indica risco para os arraçoadores, pois estes entram em contato direto com a água dos viveiros, se expondo, dessa forma, ao perigo. Quanto aos consumidores, não haveria risco evidente, uma vez que os camarões, após a despesca, são submetidos à imersão em solução com metabissulfito de sódio, conservante que atua como antioxidante, diminuindo expressivamente a carga bacteriana, conforme relatado por PYLE & KOBURGER (1981) e GÓES et al. (2006). Além do uso do conservante, o contato com água clorada a 5 ppm nos estabelecimentos de beneficiamento, aliado aos rígidos controles quanto à contaminação bacteriana do produto na indústria, asseguram a qualidade do produto final, respaldando a segurança para os consumidores. Do mesmo modo, o fato de o camarão ser consumido cozido elimina o perigo.

CONCLUSÕES

Após avaliação da água de viveiro e de camarões Litopenaeus vannamei cultivados nas fazendas A, B e C do estado de Pernambuco, concluiu-se que:
Quanto menor o tempo de cultivo, menor a possibilidade de ocorrência da enfermidade nos camarões, que pode ser em consequência de menor quantidade de matéria orgânica;
Técnicas de manejo não interferiram na carga de víbrios, tendo sido verificadas contagens significativas na água de cultivo e nos animais procedentes de todas as fazendas;
Elevadas contagens podem ser observadas na água de cultivo e nos animais, tanto no período de estio como no das chuvas, com alteração da diversidade das espécies;
O número de víbrios nas pós-larvas, hemolinfa e hepatopâncreas são indicativos de que os animais se encontram infectados, mas não necessariamente enfermos, pois não foi visualizada lesão característica no exame a fresco;
Todos os animais das fazendas A e B são suscetíveis a vibriose, por apresentarem víbrios na hemolinfa e no hepatopâncreas, sendo necessárias apenas situações de estresse para o aparecimento dos sintomas;
A presença de espécies de importância para a saúde pública é indicativa de risco para os tratadores, que entram em contato direto com a água dos viveiros. No entanto, não há risco eminente para os consumidores, uma vez que os camarões são submetidos à imersão em solução conservante antes de serem enviados para a indústria, onde são colocados em contato com água clorada, além do fato de serem consumidos cozidos.

AGRADECIMENTO

À Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP/RECARCINE-Enfermidades), pelo auxílio financeiro, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela concessão de bolsas de Desenvolvimento Tecnológico e Industrial (DTI) e de Iniciação Tecnológica e Industrial (ITI).

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Protocolado em: 5 nov. 2007. Aceito em: 5 dez. 2008.