DOI: 10.1590/1089-6891v17i218391
MEDICINA VETERINÁRIA
ATIVIDADE ANTIBACTERIANA IN VITRO DO EXTRATO DE Abarema cochliacarpos (GOMES) BARNEBY & J.W. GRIMES CONTRA BACTÉRIAS ISOLADAS DE FERIDAS CUTÂNEAS DE CÃES
Rodrigo Ferreira Lima Tenório1*
Márcia Silva do Nascimento2
José Vitor Moreira Lima Filho3
Maria Bernadete de Sousa Maia4
Maria Cristina de Oliveira Cardoso Coelho5
1Programa de Pós-Graduação em Ciência Veterinária, Universidade Federa Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil.
2Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brasil.
3Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil.
4Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brasil.
5Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil.
*Autor para correspondência: rodrigofltenorio@yahoo.com.br
Abarema cochliacarpos é uma espécie nativa do Brasil, pertence à família Leguminosae - Mimosoidae, muito utilizada na medicina popular. Objetivou-se avaliar a atividade antibacteriana in vitro dos extratos ciclohexânico, acetônico e etanólico da casca de Abarema cochliacarpos (Gomes) Barneby & J.W. Grimes contra bactérias isoladas de feridas cutâneas de cães. A atividade antibacteriana dos extratos foi determinada pelo método de difusão em meio sólido enquanto que a Concentração Mínima Inibitória foi determinada em microplacas. Alíquotas dos poços sem crescimento bacteriano após 24h de incubação a 35-37 oC foram adicionadas em placas com meio de cultura para determinação da Concentração Mínima Bactericida. A análise fitoquímica da planta revelou resultados positivos para alcalóides, flavonóides, saponinas, taninos (condensáveis), terpenos e esteróides. As bactérias isoladas foram: Staphylococcus intermedius, Bacillus sp., Pasteurella sp. e Escherichia coli. Os ensaios in vitro dos extratos da casca de Abarema cochliacarpos mostraram inibição contra as bactérias Gram-positivas Staphylococcus intermedius e Bacillus sp. nas concentrações testadas (100, 50, 25, 12,5 e 6,25 mg/mL), exceto para o extrato em ciclohexano que não demonstrou inibição nas concentrações de 12,5 e 6,25 mg/mL contra o Staphylococcus intermedius. Não houve halos de inibição frente aos isolados Gram-negativos Pasteurella sp. e Escherichia coli. Concluiu-se que os extratos ciclohexânico, acetônico e etanólico da casca de Abarema cochliacarpos mostraram atividade antibacteriana, para a maioria das concentrações testadas, frente às cepas Gram-positivas Staphylococcus intermedius e Bacillus sp. isoladas de feridas cutâneas de cão. Palavras-chave: ação antibacteriana; barbatimão; fitoquímica; Mimosoidae; taninos.
Abarema cochliacarpos is a native species of Brazil, it belongs to the family Leguminosae - Mimosoidae, and it has been long used in folk medicine. This study aimed to evaluate the in vitro antibacterial activity of cyclohexane, acetone, and ethanol extracts of the bark of Abarema cochliacarpos (Gomes) Barneby & JW Grimes against bacteria isolated from skin wounds in dogs. The antibacterial activity of the extracts was determined by the diffusion method on solid medium while the Minimal Inhibitory Concentration was determined in microplates. Aliquots of the wells without bacterial growth after 24 hours of incubation at 35-37 oC were added to plates with culture medium to determine Minimum Bactericidal Concentration. The phytochemical analysis of the plant showed positive results for alkaloids, flavonoids, saponins, tannins (condensed), terpenes and steroids. The isolated bacteria were: Staphylococcus intermedius, Bacillus sp., Pasteurella sp., and Escherichia coli. In vitro assays of the extracts of the bark of Abarema cochliacarpos showed inhibition against Gram-positive bacteria Staphylococcus intermedius and Bacillus sp. concentrations tested (100, 50, 25, 12.5 and 6.25 mg / mL) except for the cyclohexane extract that showed no inhibition at concentrations of 6.25 and 12.5 mg / mL against Staphylococcus intermedius. There were no zones of inhibition against the Gram-negative bacteria Pasteurella sp. and Escherichia coli. We concluded that the cyclohexane, acetone, and ethanol extracts of the bark of Abarema cochliacarpos showed antibacterial activity for most tested concentrations against the strains Gram-positive Staphylococcus intermedius and Bacillus sp. isolated from skin wounds in dogs.
Enviado em: 03 maio de 2012
Aceito em: 16 março de 2016
A propriedade antisséptica das plantas medicinais e aromáticas e de seus extratos tem sido observada desde a antiguidade, enquanto as informações sobre as tentativas de se caracterizar suas propriedades em laboratório remontam ao início de 1900 (1). Com o passar do tempo, o conhecimento sobre as plantas evoluiu como consequência, em grande parte, das modernas tecnologias, ocasionando o isolamento sistemático e a caracterização dos princípios ativos contidos nestas fontes vegetais (2). As plantas têm sido uma fonte valiosa de produtos para manutenção da saúde humana, sendo mais difundidas especialmente nos últimos anos, após numerosos estudos com produtos terapêuticos de plantas medicinais (3).
Abarema cochliacarpos é uma espécie nativa do Brasil, pertence à família Leguminosae - Mimosiodae, que apresenta porte arbóreo, atingindo cerca de 8 m de altura. Ocorre principalmente no litoral da Mata Atlântica, distribuída pelos Estados da Bahia, Espírito Santo e Paraíba podendo ser encontrada na caatinga, no cerrado em campos rupestres, às vezes atingindo altitudes de até 1.100 metros (4). Trata- se de uma árvore frondosa de pequeno a médio porte, possuindo folhas compostas, inflorescência em glomérulos globosos, flores ligeiramente amareladas, frutos do tipo legume contorcido e sementes brancas acinzentadas, amplamente utilizada in natura no Brasil como planta medicinal (3). Segundo a União Internacional de Conservação da Natureza e Recursos Naturais – IUCN,(4) a espécie está classificada como vulnerável à extinção.
A espécie é popularmente conhecida como barbatimão, babatenom, barba-de-timão, entre outras, além de ser utilizada na recuperação de áreas degradadas, apresenta grande valor medicinal (3, 5-8). No Brasil, outras espécies de barbatimão são conhecidas pelo mesmo nome popular (Stryphnodendron adstringens, S. ovobatum, S. polyphyllum, S. barbatimam, Dimorphandra mollis) e utilizadas para os mesmos fins terapêuticos (7, 9). Na medicina caseira, o decocto das cascas desta planta é amplamente empregado na maioria das regiões do Brasil no tratamento da leucorréia, hemorragias, diarréia, hemorróidas, para limpeza de ferimentos e na forma de gotas contra conjuntivite (3, 7, 9-11). Segundo Silva et al.,(7) as propriedades farmacológicas desta planta ainda não foram extensamente investigadas e poucos estudos têm sido relatados. Neste contexto, objetivou-se avaliar a atividade antibacteriana in vitro dos extratos ciclohexânico (ECH), acetônico (EA) e etanólico (EE) da casca de Abarema cochliacarpos (Gomes) Barneby & J.W. Grimes contra bactérias isoladas de feridas cutâneas em cães.
A identificação da espécie botânica foi realizada no Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA, e a exsicata encontra-se depositada no acervo do Herbário IPA – Dárdano de Andrade Lima, sob o número de registro 87.031.
O material foi coletado na Ilha de Itamaracá – PE, nas proximidades da comunidade do Pilar. As cascas foram coletadas pela manhã, acondicionadas em sacos plásticos sob temperatura ambiente, e levados ao Laboratório de Bioterápicos do Departamento de Medicina Veterinária (DMV) da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). As cascas foram espalhadas em uma superfície lisa recoberta com papel madeira à temperatura ambiente por 24h, em seguida levada à estufa para
a desidratação artificial sob temperatura controlada de 50 °C / 48h. O material foi triturado em liquidificador industrial e armazenado em sacos plásticos e levados para o Laboratório de Química de Produtos Naturais da Universidade Federal de Pernambuco (UFPE) para o preparo dos extratos e análise fitoquímica da planta.
Visando à identificação dos metabólitos secundários presentes na casca da planta em estudo, foram realizados testes fitoquímicos baseados na metodologia descrita por Costa (12). Os compostos analisados estão descritos no Quadro 1.
Cerca de 500 g do pó da casca seca foram submetidos à extração à temperatura ambiente, com 2 L de ciclohexano por 3 dias com troca de solvente a cada 24 horas; em seguida o mesmo procedimento foi realizado com acetona e finalmente com etanol (Figura 1). Os extratos foram concentrados em rotavapor (modelo BUCHI ROTAVAPOR RII), acoplado a uma bomba a vácuo (modelo TECNAL 0581), secos e armazenados em dessecador, pesados e calculados seus rendimentos.
A coleta do material microbiológico foi realizada no Hospital Veterinário do DMV da UFRPE. As amostras foram coletadas de cães que apresentavam traumas com perda cutânea lácero-contusa provocadas por diversas causas. Para a coleta do material bacteriano não houve distinção entre sexo, raça, idade e localização da lesão. Antes de qualquer procedimento, para o tratamento da lesão, foi utilizado suabe estéril na área cruenta percorrendo todo o diâmetro da ferida. Em seguida, o material biológico foi levado ao laboratório de bacteriose do DMV da UFRPE e transferido para placas contendo ágar sangue. As amostras coletadas foram incubadas em estufa a 37 °C por 24 à 48h.
A identificação dos isolados foi realizada no Laboratório de Microbiologia e Imunologia – LAMIN da UFRPE, através da análise ao microscópio óptico comum pela técnica de Gram e com auxílio de Kits comerciais (Biomerieux): Kit API 20-E, para a identificação das enterobacteriaceae e outros bacilos, e Kit API Staph, para cocos Gram-positivos. As bactérias identificadas encontram-se no Quadro 2.
A atividade antimicrobiana dos extratos foi determinada pelo método de difusão em meio sólido. Colônias isoladas em placas de Petri crescidas por 24h/37 C em meio Ágar Mueller-Hinton foram suspensas em solução tampão PBS e o inóculo padrão foi ajustado na escala 0,5 de McFarland, com aproximadamente 108 células/mL. Em seguida, poços de 5 mm em diâmetro foram cavados no meio de cultura e, com auxílio de suabe estéril, as culturas foram semeadas na superfície do Agar.
Posteriormente, cada extrato seco foi diluído com Dimetilsulfóxido (DMSO) nas concentrações de 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 mg/mL e, em seguida, utilizando-se uma pipeta automática, 20 µL foram adicionados em cada poço. As placas cultivadas foram deixadas em temperatura ambiente por 20 minutos para facilitar a difusão dos extratos. Após 24h de incubação a 37 ºC, o diâmetro do halo inibitório ao redor dos discos foi medido com auxílio de uma régua. Os testes foram realizados em duplicata e DMSO foi utilizado como controle negativo.
A Concentração Mínima Inibitória (MIC) foi realizada pelo método de diluição em caldo, utilizando- se microplacas de 96 poços contendo Ágar Mueller-Hinton, com concentrações dos extratos ciclohexânico (ECH), acetônico (EA) e etanólico (EE) que variaram de 10 – 0,0162 mg/mL. O MIC foi a menor concentração do extrato que causou a inibição visível do crescimento; a concentração bactericida mínima (MBC) foi a concentração mais baixa, que resultou em ausência de crescimento após a incubação no período de tempo de 24h a 37 ºC. Todos os ensaios foram realizados em duplicata.
Os extratos apresentaram os seguintes rendimentos: 0,2% (ECH), 22,54% (EA) e 10,41% (EE). A análise fitoquímica da planta revelou resultados positivos para alcalóides, flavonóides, saponinas, taninos (condensáveis), terpenos e esteróides (Quadro 3). Resultados semelhantes foram encontrados por Silva et al.(7), que confirmaram a presença de saponinas, catequinas, taninos, fenóis e antraquinonas, mas constataram ausência de alcalóides e esteróides/triterpenóides. Silva et al. (13), em estudos fitoquímicos por espectrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear, revelaram que as catequinas são um componente importante na classe dos taninos condensáveis.
Os ensaios da atividade antibacteriana in vitro dos extratos (ECH, EA, EE) da casca de Abarema cochliacarpos mostraram inibição contra a bactéria Gram-positiva Staphylococcus intermedius em todas as concentrações testadas (100, 50, 25, 12,5 e 6,25 mg/mL), exceto para o extrato em ciclohexano, que não demonstrou inibição nas concentrações de 12,5 e 6,25 mg/mL. Os extratos apresentaram atividade frente à cepa Gram-positiva Bacillus sp. em todas as concentrações testadas (Tabela 1).
Santos et al. (3) encontraram resultados satisfatórios com o extrato hidroalcoólico da A. cochliacarpos quando aplicados em cepas Gram-positivas (Staphylococcus aureus ATCC6835, Staphylococcus aureus isolados de amostra clínica, Micrococcus luteus). A espécie A. cochliacarpos demonstra eficiência quando testadas contra as cepas Gram-positivas. Santos et al. (14) atribuem a atividade farmacológica aos taninos. A ação de taninos reagindo com a membrana celular de microrganismos e organelas celulares têm sido relatadas por Scalbert (15), que verificaram que a inibição da fosforilação oxidativa por mitocôndrias e a modificação na integridade de membranas na presença de ácido tanínico são os mecanismos responsáveis pelas suas propriedades bactericidas.
Segundo Santos et al. (3), a capacidade de inibição do crescimento bacteriano do extrato da casca de cochliocarpos frente às cepas Gram-positivas, provavelmente, pode estar diretamente relacionada com a estrutura da parede celular. Tendo em vista que a principal característica das bactérias Gram-negativas é a presença da membrana externa agindo como barreira para certos tipos de antibióticos, enzimas digestivas, detergentes e metais pesados, possivelmente esta membrana protege as bactérias da ação dos extratos de A. cochliocarpos. Silva et al. (16) também confirmam os efeitos inibitórios dos extratos aquoso e metanólico da casca de A. cochliocarpos frente às cepas Gram-positivas (Staphylococcus aureus ATCC6835, Staphylococcus aureus de amostras clínicas multirresistentes, Micrococcus luteus) e a Gram-negativa Salmonella choleraesuis.
O teste para a concentração mínima inibitória (MIC) dos extratos ECH, EA, EE foi realizado com as bactérias Staphylococcus intermedius e Bacillus sp., por apresentarem inibição nos testes de sensibilidade. No entanto, o valor do MIC não pode ser determinado, uma vez que os extratos não foram inibitórios em concentrações inferiores a 10 mg/mL (MIC > 10 mg/mL). A Concentração Bactericida Mínima (MBC) foi avaliada com as concentrações de 10, 5 e 2,5 mg/mL, havendo crescimento das bactérias em todas as placas incubadas (Figura 3). Resultados diferentes foram encontrados por Santos et al. (3) que apresentaram um MIC de 0,1562 mg/mL do extrato hidroalcoólico da casca de Abarema cochliacarpos para Micrococcus luteus e de 0,3125 mg/mL para Staphylococcus aureus ATCC6835. Na Figura 2 observa-se a difusão dos extratos no meio de cultura sem a ocorrência de halo inibitório contra os isolados Gram-negativos Pasteurella sp. e Escherichia coli.
Silva et al. (16) relataram um MIC de 5 µg/mL do extrato metanólico para Staphylococcus aureus ATCC6835 e 10 µg/mL para Micrococcus luteus. As diferenças de concentração mínima inibitória podem estar relacionadas ao solvente utilizado para a extração dos metabólitos e também ao tipo de cepa selecionada para os ensaios antibacterianos. No entanto, é necessário purificar, isolar e identificar os componentes bioativos desta planta para novos testes, que atuam na inibição do crescimento de bactérias e na atividade bactericida.
De acordo com os resultados anteriores, a espécie Abarema cochliacarpos, conhecida como barbatimão e utilizada na medicina popular, possui um espectro satisfatório de atividade antibacteriana, principalmente contra cepas Gram-positivas do gênero Staphylococcus.
Os ensaios desenvolvidos com os extratos ciclohexânico, acetônico e etanólico da casca de Abarema cochliacarpos mostraram atividade antibacteriana, para as concentrações 100, 50, 25, 12,5 e 6,25 mg/ mL frente às cepas Gram-positivas Staphylococcus intermedius e Bacillus sp. isoladas de feridas de cão.
Abarema cochliacarpos possui potencial farmacológico contra bactérias Gram-positivas, principalmente do gênero Staphylococcus, podendo ser explorada em pesquisas futuras para obtenção de compostos bioativos de ação antibacteriana.
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