DOI: 10.5216/cab.v14i3.17170
AVALIAÇÃO
DE EMBRIÕES OVINOS PROVENIENTES DE OÓCITOS SUBMETIDOS A ESTRESSE
CALÓRICO DURANTE A MATURAÇÃO IN VITRO
Edivaldo
Rosas dos Santos Junior1; Ricardo
Macêdo Chaves2, José Carlos Ferreira da Silva4;
Marcelo Tigre Moura4; Cláudio Coutinho Bartolomeu4;
Paulo Bayard Dias Gonçalves3; Paulo Fernandes de Lima4;
Marcos Antônio Lemos de Oliveira4
1Universidade
Federal
Rural de Pernambuco, Unidade Acadêmica de Serra Talhada, Serra Talhada –
PE, Brasil edivaldorosas@gmail.com*
2Laboratório
de
Reprodução Animal – Universidade Estadual do Maranhão, São Luis – MA,
Brasil
3Universidade
Federal
de Santa Maria, Av. Roraima nº 1000 - Cidade Universitária - Bairro
Camobi - Santa Maria – RS, Brasil
4Laboratório
de
Biotécnicas da Reprodução do Departamento de Medicina Veterinária
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Dois Irmãos s/n, Recife-PE, Brasil.
RESUMO
Neste
trabalho
foi avaliado o efeito do estresse calórico durante a maturação de
oócitos sobre a produção in vitro
de embriões ovinos. Os ovários foram obtidos em abatedouro e os oócitos
colhidos de folículos de 2 a 6 mm de diâmetro. Após seleção, os oócitos,
em 10 replicações, foram colocados para maturação in
vitro (MIV) durante 24 horas. Os oócitos submetidos ao estresse
térmico de 41º C durante 3, 6, 12, 18 e 24 horas foram posteriormente
transferidos para completar a MIV a 39 ºC, mesma temperatura utilizada
para maturação dos oócitos do grupo controle. O desenvolvimento dos
embriões foi determinado nos dias 3, 4, 5 e 8 pós-fecundação. A
avaliação da qualidade dos embriões foi efetuada através da contagem
total de células coradas pelo DAPI e da determinação do número de
blastômeros positivos para apoptose através do teste de TUNEL.
Observou-se que o estresse térmico diminuiu (P < 0,05) a capacidade
de maturação dos oócitos de acordo com o tempo de exposição à
temperatura de 41º C. No grupo de oócitos incubados a 39° C, 70,70%
maturou, enquanto que nos grupos expostos ao estresse térmico, apenas
45,28%, 35,17%, 12,30%, 9,74% e 4,60% maturaram, respectivamente, após
3, 6, 12, 18 e 24 horas de incubação. A duração de exposição dos oócitos
ao estresse calórico foi inversamente proporcional (P < 0,05) à
capacidade de desenvolvimento embrionário e diretamente proporcional (P
< 0,05) ao número de blastocistos positivos para apoptose. Todavia, o
efeito deletério do estresse térmico sobre a clivagem e os embriões nos
estádios de 8 a 16 células e de mórula foi crescente (P > 0,05)
somente até 18 horas de incubação. Os resultados permitem concluir que o
estresse calórico durante a maturação in vitro de oócitos reduz a
quantidade e a qualidade dos embriões ovinos produzidos in vitro
determinadas pela alta incidência de apoptose.
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EVALUATION OF SHEEP OOCYTES
SUBMITTED TO HEAT STRESS DURING IN VITRO MATURATION
ABSTRACT
The aim of this
work was to evaluate the effect of heat stress during oocyte maturation
on ovine in vitro embryo production. Ovaries were collected at abattoirs
and oocytes retrieved from follicles ranging from 2 and 6 mm in
diameter. After selection, all oocytes, in 10 replicates, were placed in
in vitro maturation (IVM) during 24 hours. The oocytes were submitted to
heat stress of 41º C during 3, 6, 12, 18 and 24 hours and were further transferred to 39º C in order to
complete IVM, which was the temperature of maturation of control
oocytes. Embryonic development was determined on days 3, 4, 5, and 8
post-fertilization. Embryo evaluation was performed as total cell count
by DAPI staining and determination of positive blastomere for apoptosis
by the TUNEL assay. We observed that heat stress diminishes (P <
0.05) oocyte maturation capacity in accordance with exposure time of 41º
C. In the group of oocytes incubated at 39 ºC, 70.70% matured, while in
the groups exposed to heat stress at 41º C, only 45.28%, 35.17%, 12.30%,
9.74% and 4.60% matured, respectively, after 3, 6, 12, 18, 24 hours of
incubation respectively. The duration of exposure to heat stress was inversely
proportional (P < 0.05) to embryonic developmental capacity and directly
proportional (P < 0.05) to the number of blastocysts
positive to apoptosis. However, the cleavage rate and embryonic
development from 8 to 16 cells and morulae stages were affected by heat
stress (P > 0.05) only up to 18 hours of incubation. The results
allow the conclusion that heat stress during oocyte in vitro maturation reduces the quantity and quality of ovine
embryos produced in vitro
determined by the high incidence of apoptosis.
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INTRODUÇÃO
A cadeia produtiva da ovinocultura do Nordeste brasileiro já mostrou sua
potencialidade como uma atividade que se adapta bem às adversas
condições climáticas da região, que é reconhecida pelo potencial para
produção de carne e pele ovina (SIMPLÍCIO et al., 2007). A elevada
temperatura no ambiente é um dos principais fatores responsáveis pela
redução da fertilidade de animais criados em fazendas (HANSEN, 2009).
Tem sido relatado que a viabilidade de oócitos e de embriões bovinos é
menor durante as estações quentes do que na época fria (ROTH, 2008;
EDWARDS et al., 2009). Essa depressão estacional do desempenho
reprodutivo pode ser determinada por múltiplos fatores, incluindo
manejo, ambiente inadequado, idade e sensibilidade espécie-específica a
esses fatores (BADINGA et al., 1985).
Estudos in vitro têm
demonstrado também que o estresse calórico tem efeito negativo sobre a
viabilidade e a capacidade de desenvolvimento de embriões mamíferos (JU
et al., 1999; PAULA-LOPES & HANSEN, 2002ab; TSENG et al., 2004;
ROTH, 2008; HANSEN, 2009).
Diante do abordado, avaliou-se o efeito do estresse calórico durante a
maturação de oócitos sobre a produção in
vitro de embriões ovinos, objetivando fornecer dados relacionados
aos mecanismos de morte celular e redução da competência de oócitos de
animais naturalmente expostos à elevada temperatura ambiente.
MATERIAL
E
MÉTODOS
Os ovários foram obtidos de fêmeas ovinas em abatedouro localizado na
Região Metropolitana da cidade do Recife - PE que apresenta, como
coordenadas geográficas, latitude 08° 03' 14'' S e longitude 34° 52'
52'' W. Na estação seca, outubro de 2009 a março de 2010, a temperatura
ambiente variou de 23 a 33º C e a umidade relativa média foi de 71%. Na
estação chuvosa, abril a setembro de 2010, a temperatura oscilou de 18 a
31°C e a umidade relativa média foi de 85% durante o ano de 2009 (INMET,
2009).
No período máximo de uma hora após o abate, os ovários foram transportados
ao laboratório em garrafa térmica contendo solução fisiológica aquecida
a 30º C, que foi acrescida de 30 g mL-1 de sulfato de
gentamicina. Os oócitos, colhidos de folículos ovarianos medindo de 2 a
6 mm de diâmetro, foram depositados em placa de Petri contendo o meio de
colheita constituído por 8,0 mg de bicarbonato de sódio, 45,0 mg de
glicose, 5,6 mg de piruvato de sódio, 11,9 mg de HEPES, 2,5 mg de
sulfato de gentamicina e 20,0 mg de álcool polivinílico em 50 mL de
TALP.
Imediatamente após a seleção e com base na classificação morfológica
descrita por CHIAMENTI et al. (2013), os oócitos, em 10 réplicas, foram
lavados três vezes no meio de colheita e distribuídos nas gotas de 100 μL do meio básico de maturação in vitro constituído pelo TCM 199, suplementado com 50 g mL-1
de piruvato de sódio, 2,6 mg mL-1 de bicarbonato de sódio,
10% de soro fetal bovino (SFB), 50 g mL-1 de sulfato de
gentamicina, 20 μg mL-1
de FSH/LH (Pluset®) e 1 mg mL-1 de álcool polivinílico.
A maturação in vitro foi
realizada durante 24 horas em atmosfera úmida contendo 5% de CO2.
Os oócitos do grupo controle foram incubados à temperatura de 39º C e os
submetidos ao estresse calórico de 41º C durante 3, 6, 12, 18 e 24 horas
de incubação, com exceção do grupo de 24 horas, foram posteriormente
transferidos para outra estufa à temperatura de 39º C para completar a
maturação in vitro.
Ao término do período de maturação in
vitro, procedeu-se à seleção dos oócitos, com base na expansão das
células do cumulus (CHIAMENTI et al., 2013), para exposição aos
espermatozóides tratados com meio definido modificado (mDM), segundo
KESKINTEPE et al. (1998). O referido meio foi constituído de 0,1250 g de
glicose, 0,1552 g de bicarbonato de sódio, 0,0069 g de piruvato de
sódio, 0,0500 g de álcool polivinílico, 0,0500 g de cafeína e 50 μg
mL-1 de gentamicina em 50 mL do mDM. A fecundação in vitro foi realizada com sêmen fresco na concentração espermática
de 2 X 106/mL.
Decorridas 18 horas da incubação, os possíveis zigotos foram desnudados e
transferidos para gotas de 100 μL
do fluido sintético de oviduto modificado, suplementado com 10% de soro
fetal bovino. Os possíveis zigotos foram incubados a 39° C em atmosfera
úmida contendo 5% de CO2, 5% de O2 e 90% de N2
durante oito dias, dependendo do grupo experimental. Ressalta-se que as
avaliações foram efetuadas no terceiro dia (D-3) quanto à clivagem, no
quarto (D-4) dos embriões com 8 a 16 células, no quinto (D-5) daqueles
no estádio de mórula e no oitavo dia (D-8) dos blastocistos.
Após o período de cultivo embrionário, a qualidade dos blastocistos foi
avaliada por meio da contagem total de células com o corante DAPI e a
avaliação da fragmentação de DNA foi realizada através do teste
“terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick and labeling”
(TUNEL), conforme recomendação de PAULA-LOPES & HANSEN (2002a), bem
como de ROTH & HANSEN (2004). As avaliações acima descritas foram
realizadas com auxílio de um microscópio de fluorescência, com aumento
de 1000x.
A estatística foi realizada através da análise de variância pelo método
dos quadrados mínimos. Os resultados foram expressos em média e
desvio-padrão (análise de variância entre grupos). Os dados em
porcentagens foram transformados para arco seno da raiz quadrada de
x/100 e submetidos à análise de variância e ao teste F para variâncias a
5% de significância. Os dados foram transformados e não foram analisados
por um método não-paramétrico para preservar o modelo experimental. Em
seguida, um teste t de Student para comparação entre médias foi
realizado, a 5% de significância, para variâncias equivalentes ou
variâncias distintas, conforme o que foi verificado no teste F para
variância.
RESULTADOS
Na
Tabela
1 pode ser observado que o estresse calórico diminui (P
< 0,05) a capacidade de maturação dos oócitos de acordo com o tempo de
exposição à temperatura de 41º C. No grupo de oócitos incubados a 39º C,
70,70% deles maturou, enquanto que os oócitos expostos ao estresse térmico
de 41º C, apenas 45,28%, 35,17%, 12,30%, 9,74% e 4,60% maturaram,
respectivamente, nos grupos incubados por 3, 6, 12, 18 e 24 horas.
Os
dados contidos na Tabela
2 revelam que a duração de exposição dos oócitos ao
estresse calórico é inversamente proporcional (P < 0,05) à capacidade
de desenvolvimento embrionário até o estádio de blastocisto e diretamente
proporcional (P < 0,05) ao número de blastocistos positivos para
apoptose (P < 0,05). Todavia, o efeito deletério do estresse térmico
sobre a clivagem e os embriões nos estádios de 8 a 16 células e de mórula
foi semelhante(P > 0,05) somente até 18 horas de incubação.
DISCUSSÃO
EDWARDS & HANSEN (1997), JU et al. (1999), ROTH &
HANSEN (2004), TSENG et al. (2004) e ROTH (2008) demonstraram por que, em bovinos, alterações
no microambiente do oócito, in vivo
e in vitro, provocadas por
estresse térmico, afetam a viabilidade e a cinética de desenvolvimento
embrionário.
O efeito do estresse térmico
sobre os oócitos e embriões de mamíferos in
vitro é dependente da temperatura e da duração da hipertermia. JU et
al. (1999) relataram que a temperatura de 43º C reduz tanto a competência
dos oócitos quanto o desenvolvimento embrionário bovino, mesmo com tempo
de exposição de apenas 45 minutos. Neste trabalho, a escolha do tempo de
exposição ao estresse térmico foi baseada em estudos anteriores de JU
& TSENG (2004) e de PAYTON et al. (2011), que demonstraram a
susceptibilidade do oócito ao estresse térmico de 41° C sob diferentes
intervalos de tempo. Além disso, a temperatura de 41° C reflete o valor
médio de temperatura corporal aferida em animais expostos ao estresse
térmico in vivo (RIVERA &
HANSEN, 2001). Os dados aqui obtidos corroboram as observações de que a
maturação dos gametas foi reduzida proporcionalmente à duração de
exposição ao estresse térmico de 41° C.
O intervalo entre a maturação
do oócito e a primeira clivagem é, segundo EALY et al. (1995), o período
mais susceptível aos efeitos do estresse calórico no desenvolvimento
embrionário e, após a ativação do genoma, o embrião torna-se mais
resistente ao estresse (EDWARDS & HANSEN, 1997; JU et al., 1999).
Neste trabalho, o estresse térmico durante a maturação dos oócitos, mesmo
após períodos mais curtos de incubação, evidenciou efeito acentuado sobre
o desenvolvimento embrionário. A redução na produção in
vitro de embriões até o estádio de mórula foi proporcional à duração
do estresse térmico, exceto entre 18 e 24 horas de incubação, que tiveram
taxas semelhantes da clivagem até a fase de mórula. Esse fato sugere que o
período de maturação nuclear dos oócitos seja crítico para a
susceptibilidade do gameta ao estresse térmico (TSENG et al., 2004).
Todavia, os grupos de 18 e 24 horas de estresse diferiram na produção de
blastocistos, possivelmente devido à qualidade destes embriões.
O estresse térmico induz a
apoptose dos oócitos e embriões (EDWARDS & HANSEN, 1997; ROTH &
HANSEN, 2004). A apoptose tem um efeito direto sobre a viabilidade dos
embriões, pois, com a inibição da atividade das caspases do tipo II, a
taxa de clivagem é recuperada após o estresse térmico em bovinos (ROTH
& HANSEN, 2004). Quanto à qualidade dos embriões deste trabalho, o
percentual de blastômeros apoptóticos produzidos, a partir de oócitos
expostos ao estresse térmico com tempos de exposições de 6 e 12 horas,
assemelha-se aos de PAULA-LOPES & HANSEN (2002a), obtidos em bovinos
após exposição a 41° C por 9 horas. Esses autores afirmam também que é
possível observar maior incidência de apoptose após estresse mais severo,
comprometendo o desenvolvimento embrionário, como observado neste estudo,
durante os períodos de incubação de 18 e 24 horas, em que a apoptose nos
blastocistos chegou a 71,42 e 100%, respectivamente.
A indução da apoptose após o
choque térmico em bovinos e outros mamíferos foi aqui observada em
embriões ovinos in vitro,
sugerindo que a baixa viabilidade dos embriões expostos à hipertermia no
trato reprodutivo feminino pode ser uma causa de perdas gestacionais
durante o período pré-implantacional na espécie ovina. O melhor
entendimento das respostas fisiológicas das células, gametas e embriões
submetidos ao estresse térmico pode permitir o desenvolvimento de
protocolos para a produção de embriões que melhor resistam ao estresse
térmico in vitro e in
vivo (WANG et al., 2009; ANDREU-VAZQUEZ et al., 2010;
SHEHAB-EL-DEEN et al., 2010; PAYTON et al., 2011). Por exemplo, a adição
de retinóides melhora a maturação in
vitro dos oócitos expostos ao estresse térmico (LAWRENCE et al.,
2004; MAYA-SORIANO et al., 2012).
CONCLUSÃO
Os resultados permitem
concluir que a duração de exposição ao estresse calórico durante a
maturação in vitro de oócitos
ovinos é inversamente proporcional à quantidade e à qualidade dos embriões
produzidos in vitro.
AGRADECIMENTOS
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico -
CNPq, à Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco
– FACEPE e à Empresa Suimax pelo suporte para a condução desta pesquisa.
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Protocolado
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08 fev. 2012. Aceito em 13
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