O ambiente do rúmen favorece o desenvolvimento contínuo da população microbiana, atuando como câmera de fermentação, devido aos seguintes fatores: temperatura ideal média de 39ºC; anaerobiose; pH tampão médio de 6,8; presença de bactérias, protozoários e fungos; suplemento de nutriente e contínua remoção de digesta e dos produtos de fermentação; matéria seca entre 10 a 15% e pressão osmótica constante (LANA, 2005).

As bactérias e protozoários ciliados do rúmen são responsáveis pela digestão de 70% a 85% da matéria seca digestível da ração. Esses microrganismos são adaptados para se desenvolver na ausência de oxigênio à temperatura de 39ºC a 40ºC. A partir da digestão dos alimentos, produzem os ácidos graxos voláteis, que servem como fonte de energia, além de dióxido de carbono, metano e amônia. Outro aspecto, é que os microrganismos são fonte de proteína natural para os ruminantes. A síntese de proteína microbiana no rúmen depende do crescimento e da eficiência dos microrganismos na utilização dos substratos energéticos e nitrogenados, sendo o principal constituinte corporal do animal e, portanto, vital para os processos de manutenção, crescimento e reprodução (SILVA et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2007).

Estima-se que os ciliados, que constituem a maioria dos protozoários presentes no rúmen, respondam por cerca de 2% do peso do conteúdo ruminal, 40% do nitrogênio microbiano e proporcionem 60% dos produtos da fermentação microbiana nesse órgão (YOKOYAMA & JOHNSON, 1988). O pH do conteúdo ruminal é fator determinante na concentração e composição da população bacteriana e de protozoários (FRANZOLIN et al., 2000; KAMRA, 2005). Portanto, os excessos ou deficiências de substratos alimentares produzem desequilíbrios na população microbiana e no ambiente ruminal. Essas anormalidades nutricionais podem resultar em mudanças, demasiadamente rápidas, sem que haja tempo para adaptação microbiana. Consequentemente, tem-se o crescimento excessivo de determinados tipos de bactérias, com a hiperprodução de certos produtos finais da digestão microbiana, ou a insuficiente degradação do substrato e a inatividade da microflora. Os efeitos dessas anormalidades sobre o animal variam desde a disfunção da motilidade ruminal, crescimento e desempenho deficientes, até total toxidez e lesão nos diferentes organismos (DIRKSEN, 1993; FRAZOLIN et al., 2000).

Para BORGES et al. (2002) e COSTA et al. (2008), a análise do fluido ruminal é de indiscutível valor no diagnóstico de enfermidades ligadas ao aparelho digestivo dos ruminantes, especialmente aquelas dos compartimentos pré-gástricos, pois a microbiota do rúmen é altamente sensível às alterações externas e internas às quais rotineiramente estão submetidos os animais. A manipulação do ambiente ruminal, considerando as múltiplas inter-relações entre dieta e microrganismos, tem sido objeto de estudos na expectativa de encontrar meios de melhorar a eficiência do sistema de produção (PEREIRA, et al. 2000; KAMRA, 2005; VIEIRA et al., 2007; SOUZA et al., 2007; MATOS et al., 2008). Segundo DONATO et al. (1999), o conteúdo do rúmen pode ser verificado quanto aos aspectos físicos  (cor, odor, consistência, tempo de sedimentação e flotação) e quanto às características químicas (pH, fermentação de glicose, redução de nitritos e prova de redução do azul de metileno). Os parâmetros biológicos devem constar da avaliação de bactérias e de protozoários.

O presente trabalho teve por finalidade estudar as alterações físico-químicas e microbiológicas no fluido ruminal do compartimento pré-gástrico de ovinos confinados submetidos à dieta básica de feno de Brachiaria decumbens e suplementados com níveis crescentes de mistura mineral-energético-protéica.

 MATERIAL E MÉTODOS

 O estudo foi realizado na Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás, adotando-se três períodos consecutivos de 17 dias, sendo 16 dias de adaptação às dietas e um dia de colheita de liquido ruminal. Quatro ovinos adultos, machos castrados, dotados de cânula ruminal foram utilizados. Os animais foram distribuídos em um delineamento de blocos casualizados em parcelas subdivididas, sendo os tratamentos as parcelas e o tempo de colheita as subparcelas.

Os animais foram tratados com endoparasiticidas pesados e mantidos em baias ripadas individuais dotadas de comedouro e bebedouro, sendo alimentados com feno de Brachiaria decumbens complementado com mistura mineral-energético-protéica. Os suplementos que constituíram os tratamentos foram elaborados à base de milho, farelo de soja, uréia e núcleo mineral, ministrados nas quantidades de 0,5; 1,0 e 2,0g/kg de peso vivo, os quais forneceram níveis semelhantes de minerais e nitrogênio não protéico, porém diferentes de proteína verdadeira e energia (Tabela 1).

Para colheita do líquido ruminal, através da cânula ruminal implantada, foi utilizada uma bomba a vácuo, obtendo-se amostras individuais de, aproximadamente, 200 mL. Colheram-se as amostras no 17° dia do início de cada período experimental, nos tempos 0h (jejum), 2, 4 e 6 horas pós-alimentação, sendo as mesmas filtradas e analisadas imediatamente. De cada animal foram obtidas quatro amostras por dia de colheita, totalizando 12 amostras por animal. Os seguintes parâmetros foram analisados: pH (aferido por potenciômetro), provas organolépticas (cor, odor e consistência), prova de redução do azul de metileno (PRAM), densidade, motilidade e viabilidade dos protozoários, digestão de celulose, avaliação morfo-tintorial das bactérias pelo método de Gram, contagem (cel/mL de fluido ruminal) e classificação de infusórios em pequenos, médios e grandes, segundo metodologia descrita por DEHORITY (1977).

Os dados obtidos foram interpretados para determinação da análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey, a 5% de significância e algumas variáveis foram expressas em valores absolutos e percentuais e outras por meio de estatística descritiva (SAMPAIO, 2007).

 RESULTADOS E DISCUSSÃO

 As provas organolépticas no fluido ruminal do compartimento pré-gástrico de ovinos confinados submetidos à dieta básica de feno de Brachiaria decumbens e suplementados com níveis crescentes de mistura mineral-energético-protéica revelaram semelhanças entre as amostras, sendo que a cor variou entre tonalidades de verde, o odor predominou aromático e a consistência levemente viscosa (Tabela 2). Portanto, esses achados encontram-se dentro dos padrões de normalidade e são respaldados pelos relatos de DIRKSEN (1993).

VIEIRA et al. (2007) estudaram o liquido ruminal de ovinos criados em pasto de Brachiaria decumbens e constaram que no período seco a cor do fluido predominou castanha, já no período chuvoso foi a cor verde oliva, sendo as colheitas de fluido realizadas 4 a 6 horas após a alimentação matinal. Ainda de acordo com os autores, o odor foi aromático, estando mais pronunciado no período chuvoso, e a consistência levemente viscosa em ambas as estações, com maior frequência no período chuvoso. As semelhanças entres os resultados de VIEIRA et al. (2007), que corroboram em parte com os achados do presente estudo, são compreensíveis pela base da alimentação volumosa, estando a diferença observada na cor relacionada ao fornecimento de concentrado.

O pH permaneceu próximo à neutralidade (6,74 a 7,40) não havendo diferenças entre os tratamentos (P>0,05) como mostrado na Tabela 3. HOFIREK & HAAS (2001), comparando dois métodos de colheita de líquido ruminal, por sonda oroesofágica e por punção percutânea, encontraram valores de pH mais elevados no primeiro método e relacionaram tal achado ao fato de o tubo oral alcançar apenas o saco cranial do rúmen, mais rico em saliva e soluções tamponantes. Essa alteração não foi observada nos animais do presente estudo, provavelmente pelo fato de a colheita ter sido realizada a partir de animais canulados. Não houve diferença (P>0,05) ente os tratamentos, após alimentação, quanto às provas de digestão de celulose e redução do azul de metileno; no entanto, para o menor nível de suplementação, no pH mais ácido (jejum), verificou-se o maior tempo de redução do azul de metileno, diminuindo no pico de alcalinidade (de 17 para 7 minutos), ocorrido por volta de duas horas após a alimentação. O momento de maior acidez exerceu influência negativa sobre atividade bacteriana de acordo com os achados de FRANZOLIN et al. (2000).

SOUZA et al. (2007) também não observaram diferenças nos valores médios de pH do liquido ruminal, nos períodos 0, 2, 8 e 10 horas após a alimentação, em búfalos submetidos a crescentes níveis de fósforo (8, 12, 15 e 18 g diárias/animal, mantendo-se a relação volumoso:concentrado de 85:15) na dieta total à base de cana-de-açúcar.

Embora os valores do pH ruminal observados tenham permanecido próximos à neutralidade, não havendo diferenças entre tratamentos (P>0,05), no menor nível de suplementação (0,5 g/kg de PV), momento 0h - jejum, registrou-se o pH mais ácido e em 2h, o mais alcalino (P<0,05), coincidindo com o aumento da viabilidade dos protozoários, que permaneceu estável até 6h pós-alimentação (Tabela 3). No maior nível de suplementação (2,0 g/kg de PV), apesar de não ter ocorrido diferença entre horas de colheita (P>0,05), no momento do jejum, esse nível apresentou-se superior aos demais tratamentos, em percentagem (%) de protozoários viáveis (P<0,05).

Pelo Gram observou-se uniformidade em 100% das amostras, com predomínio de cocos e bastonetes Gram-negativos, independente do nível de suplementação. Algumas das características comuns de bactérias encontradas no rúmen de animais consumindo dietas ricas em forragens são (KAMRA, 2005): maioria das bactérias Gram são negativas; o número de bactérias Gram positivas tende a aumentar com a elevação da energia na dieta; pH ótimo de crescimento entre 6,0 e 6,9. UNDERWOOD (1992) relatou que nos casos agudos de acidose ruminal pode-se notar reduções severas no pH, decréscimo ou não na atividade dos protozoários, predomínio das bactérias Gram-positivas sobre as Gram-negativas e diminuição no tempo de sedimentação e flotação. No entanto, neste estudo, o pH permaneceu próximo à neutralidade, estando os padrões encontrados, no exame morfo-bacteriológico realizado por meio do esfregaço de suco ruminal corado pelo método de Gram, de acordo com as descrições de DISKSEN (1993) em bovinos a pasto.

O perfil bacteriológico encontrado nos ovinos deste estudo, apesar de confinados e alimentados com feno de Brachiaria decumbens, assemelha-se ao que foi descrito em um estudo com caprinos criados em regime de pasto, conduzido por SILVA et al. (1994). Os autores constataram valor médio de pH ao redor de 7,0, sendo que o controle microbiológico do líquido ruminal revelou a predominância dos microrganismos Gram negativos sobre os Gram positivos em 100% das amostras e a presença de cocos isolados, estreptococos, bastonetes, sarcinas, rosetas e bacilos. Já o tempo para digestão de celulose e a redução do azul de metileno, variou, respectivamente, de 41 a 59,5 horas e de 6 a 12 minutos. No trabalho desenvolvido em caprinos por esses autores, o tempo de redução de azul de metileno foi 6,21 ± 0,65 minutos e a digestão de celulose ocorreu em 50,84 ± 2,58 horas, semelhante aos valores observados no presente estudo empregando ovinos confinados.

A população de protozoários ciliados apresentou-se superior no nível mais alto de suplementação (P<0,05), sendo na ordem dos 100 mil e nos demais tratamentos na ordem dos 10 mil (cel/mL). Os pequenos protozoários prevaleceram sobre os médios e grandes, apresentado, na grande maioria dos casos, frequência igual ou superior a 90%, o que sugere o predomínio do gênero Entodinium. O predomínio dos pequenos protozoários foi também relatado por FRANZOLIN et al. (2000). O grande tamanho de protozoários pode afetar seus fluxos no rúmen, pois as espécies menores são, provavelmente, mais resistentes à fermentação ruminal. Esse aspecto, segundo LENG (1982), implica o baixo aproveitamento de proteína microbiana produzida pelos protozoários do hospedeiro, devido ao menor fluxo para as porções inferiores do trato gastrintestinal.

No presente estudo, os resultados relacionados à população de protozoários corroboram com as observações de MATOS et al. (2008), que estudaram a população de protozoários do rúmen de ovinos criados em pastagem nativa da caatinga de Pernambuco e verificaram predominância do gênero Entodinium em torno de 90%. De acordo com esses atores, houve diferença significativa no número total de protozoários e concentração média do gênero Entodinium, quanto ao horário de coleta das amostras ruminais, sendo maior antes da alimentação, semelhante ao verificado neste estudo.

MARTINELE et al. (2008) verificaram não haver diferenças significativas no número total de protozoários ciliados do rúmen de vacas alimentadas com capim-elefante e dois crescentes níveis de concentrado (apenas capim-elefante, 80% capim-elefante e 20% de concentrado e 60% de capim-elefante e 40% de concentrado). No referido estudo, o gênero Entodinium predominou nas três dietas em 73,5%, 76,9% e 72,2% do total de ciliados e os níveis de 20 e 40 % de concentrado (à base de milho em grão, farelos de algodão e de trigo e uréia) na dieta também não produziram efeitos no pH do liquido ruminal.

Registrou-se, no momento do jejum, o maior número de protozoários por mL de fluido ruminal, em 100% dos tratamentos, sendo que a população cresceu significativamente com o aumento da quantidade de suplemento fornecida (P<0,05). Contudo, a população destes tendeu a se reduzir com o passar do tempo transcorrido da alimentação, fato esse observado no maior nível de suplementação. FRANZOLIN NETO et al. (1991) detectaram níveis mais elevados de ciliados no momento do arraçoamento, decrescendo até 12 horas depois, mas aumentando em seguida até o momento imediatamente anterior à oferta da dieta. De acordo com o mostrado na Tabela 4, as análises de motilidade e densidade dos protozoários revelaram para os níveis 0,5 e 1,0 g/kg de PV, uma alteração gradativa, sugerindo o aumento na atividade dos protozoários, do jejum até às 4h, seguido de uma redução às 6h após alimentação. Mas no nível 2,0 g/kg de PV, a população de protozoários demonstrou comportamento mais estável e ativo.

Ao comparar o nível de suplementação 0,5g/kg de PV com 1,0 g/kg de PV, pode-se notar um comportamento similar dos protozoários mesmo tratando-se de quantidades diferentes de suplemento. Entretanto, observou-se para o tratamento 2,0g/kg de PV que a população de protozoários parece ter sido influenciada pela quantidade de suplemento fornecida. Essa impressão é reforçada quando se considera que foram avaliados os mesmos animais em T1, T2 e T3. Como pode ser visto nas Tabelas 2, 3 e 4 os valores das variáveis estudadas tenderam a serem superiores para o tratamento com 2,0g/kg de PV, nos quatro momentos de colheita. De acordo com SIQUEIRA & D’AGOSTO (2003), o comportamento e a distribuição dos protozoários ciliados podem ser influenciados por vários fatores, tais como dieta ingerida pelo hospedeiro, pH ruminal, intervalo de tempo após alimentação e pelas relações estabelecidas entre eles e deles com as bactérias e fungos.

Aparentemente, quando os ovinos receberam a maior quantidade de suplemento (2,0g/kg de PV), a população de protozoários ruminais foi mais sensivelmente alterada, o que pode ser verificado pelo aumento no número de infusórios (por mL de liquido ruminal), da motilidade e densidade dos protozoários. Pesquisas com dietas à base de milho e sorgo realizadas por TOWNE et al. (1990) e FRANZOLIN & DEHORITY (1996) demonstraram altas concentrações de protozoários no rúmen sob essas condições dietéticas. Contrariamente, FRANZOLIN et al. (2000), substituindo a silagem de milho por cana-de-açúcar na alimentação de ovinos, observaram o aumento linear do pH e redução do número de protozoários ciliados à medida que aumenta a porcentagem de cana-de-açúcar em detrimento da silagem de milho. Quando a cana foi fornecida como único volumoso, os autores encontraram uma população de protozoários no rúmen na ordem de 2,0 x 10⁴/mL de fluido em pH 6,9, sendo que o número de protozoários diminuiu com o aumento do teor de energia. Resultados semelhantes foram verificados por LYLE et al. (1981) e DENNIS et al. (1983), pois os autores encontraram 1,5; 2,5; e 4,1 x 10⁵ protozoários/ mL de liquido ruminal em dietas com alta, média e baixa energia, respectivamente.

Uma avaliação final dos resultados obtidos empregando-se ovinos confinados e suplementados com níveis crescentes de energia e proteína verdadeira permite inferir que a população de protozoários ciliados respondeu positivamente. No maior nível de suplementação (T3) os valores de pH mantiveram-se ao redor de 7,0 e o número de infusórios (cél/mL) maior que nos demais tratamentos (T1 e T2), sendo inicialmente da ordem dos 3x10⁵ e reduzindo em 6h após a alimentação para a ordem de 1x10⁵. FRANZOLIN et al. (2000), observaram o maior número de protozoários quando os animais receberam menor energia na dieta, ou seja, a silagem de milho como único volumoso, sendo a população de protozoários constatada da ordem de 5,0 x 10⁴/mL de liquido ruminal em pH 6,7. Portanto, diferindo dos achados de BIRD et al. (1979), que forneceram dieta à base de cana-de-açúcar para ovinos e encontraram 5,0 x 10⁵ protozoários/mL de líquido ruminal.

 CONCLUSÃO

 O pH, a prova de redução do azul de metileno e a digestão da celulose não foram influenciados pelo nível de suplementação e as características organolépticas – cor, odor e consistência – foram semelhantes para os crescentes níveis de suplementação. Na frequência de classificação dos protozoários ciliados, o quadro permaneceu estável com predomínio dos pequenos protozoários. Os níveis crescentes de suplementação influenciaram positivamente a população de protozoários ciliados do rúmen, mas não influenciaram a atividade bacteriana.

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