METABOLISMO OXIDATIVO DOS ERITRÓCITOS E ERITROGRAMA NA MASTITE EXPERIMENTALMENTE INDUZIDA POR Staphylococcus aureus EM CABRAS SUPLEMENTADAS COM VITAMINA E
Paulo Ricardo de Oliveira Paes,1 Sônia Terezinha dos Anjos Lopes,2
Raimundo Souza Lopes,3 Aguemi Kohayagawa3 e Regina Kiomi Takahira3
1. Professor adjunto, Departamento de Clínica e Cirurgia
Veterinárias, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG),
Av. Antônio Carlos, n° 6627, Caixa Postal 567, CEP 30123-970, Belo Horizonte, MG. E-mail: paulopaes@vet.ufmg.br.
2. Professora adjunto, Hospital Veterinário da Universidade Federal de Santa Maria, (UFSM)
3. Professores doutores da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, (UNESP), Campus de Botucatu,
SP.
RESUMO
A
explosão oxidativa dos neutrófilos na
reação à infecção pode resultar em
danos celulares e causar, entre outras alterações, a
anemia da doença inflamatória. O sistema glutationa e a
vitamina E são antioxidantes que inativam os radicais livres. O
presente trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da
administração de vitamina E sobre o eritrograma e a
glutationa reduzida eritrocitária (GSH) de cabras desafiadas com
a inoculação intramamária de Staphylococcus aureus
ao décimo dia pós-parto. Foram usadas 28 cabras,
primíparas, da raça Saanen, na faixa etária de dez
a dezesseis meses, distribuídas, aleatoriamente, para quatro
tratamentos, cada um com sete animais, como segue: controle (TC),
suplementação com vitamina E (TV), desafio por Staphylococcus aureus (TM) e suplementação com vitamina-E e desafio por S.aureus (TVM). Conclui-se que a inoculação de S.aureus
na glândula mamária não altera o eritrograma e a
glutationa reduzida eritrocitária e que a vitamina E favorece,
positivamente, uma melhor resposta eritrocitária.
PALAVRAS-CHAVES: Caprinos, eritrócitos, GSH, mastite, vitamina E.
ABSTRACT
ERYTHROCYTE OXIDATIVE METABOLISM AND ERITROGRAM IN MASTITIS INDUCED BY
Staphylococcus aureus ON GOATS WITH ADMINISTRATION OF VITAMIN E
The oxidative
boom of neutrophils to infection reaction can result in cellular injury
and lead to inflammatory disease anemia, among other disorders. The
glutathione system and the vitamin E are antioxidants that disable free
radicals. The aims of the present study were to evaluate the effects of
administration of vitamin E on erythrogram and erithrocyte reduced
glutathione (GSH) of 28 Saanen goats, experimentally challenged
trough intramammary route, ten days after parturition. The animals had
between ten and sixteen months of age, had their first deliver by the
time of the experiment and were randomly divided in four groups:
control (CG), vitamin E supplementation (VG), inoculated with Staphylococcus aureusS. aureus (MG) and inoculated with S. aureus
and vitamin E supplementation and (VMG). It could be concluded that
inoculation of S.aureus in mamary glands of Saanen goats produce no
change on erythrogram and on erythrocytic reduced glutathione
concentration, and the vitamin E causes a better erythrocyte response
in goats.
KEY WORDS: Erythrocytes, glutathione, goats, vitamin E.
INTRODUÇÃO
Qualquer tipo
de lesão do tecido mamário pode induzir uma resposta
inflamatória ou mastite. Entretanto, a doença do
úbere de maior relevância é aquela associada
à infecção microbiana (JAIN, 1979). Nas
infecções causadas por bactérias, a anemia
é um achado frequente, mas o agente infeccioso raramente
é o responsável pela anemia. A maioria das anemias
associadas com infecções bacterianas é causada
pela reação inflamatória, sendo denominada anemia
da doença inflamatória (STOCKHAM, 2000). Esta, segundo
WANER & HARRUS (2000), é uma anemia leve a moderada e
normocítica normocrômica que, em geral, está
associada aos processos inflamatórios, particularmente as
infecções crônicas, aos processos
traumáticos e às neoplasias. Em três a dez dias,
esses fatores podem causar diminuições no volume globular
e na concentração de hemoglobina, resultantes das
diminuições da disponibilidade do ferro, da sobrevida dos
eritrócitos, da liberação de eritropoietina e da
resposta das células precursoras da medula óssea à
anemia, constituindo-se em uma das principais causas de anemia dos
animais domésticos.
A defesa
celular da glândula mamária envolve principalmente os
neutrófilos, capazes de fagocitar uma ampla variedade de
partículas (SORDILLO et al.,
1997). Nesse processo ocorre uma explosão na
produção de metabólitos do oxigênio,
denominados radicais livres, que constituem o mais eficiente sistema
bactericida dos neutrófilos (COTRAN et al.,
1994). Os radicais livres podem modificar as estruturas da membrana e
de outros componentes celulares dos neutrófilos e, quando
liberados, podem lesionar a membrana celular de outros tipos celulares,
como, por exemplo, os eritrócitos (MILLER et al., 1993; COTRAN et al.,
1994; HARVEY, 1997). Além disso, em razão da sua
função de transportador de oxigênio, os
eritrócitos estão particularmente vulneráveis aos
radicais livres que são formados no interior da célula
durante os processos metabólicos fisiológicos,
principalmente àqueles relacionados às
funções da hemoglobina (SMITH, 1987; HARVEY, 1997). Para
proteger o organismo dessas moléculas reativas, uma ampla
variedade de sistemas antioxidantes trabalha em conjunto (MILLER et al., 1993).
As principais
enzimas antioxidantes são a superóxido dismutase (SOD), a
catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GSH-Px) (COTRAN et al.,
1994). Os radicais livres derivados do oxigênio que escapam da
degradação enzimática podem ainda ser inativados
pelos antioxidantes não enzimáticos, como o ascorbato
solúvel em água, o β-caroteno e a vitamina E. Esta
é o principal agente antioxidante lipossolúvel. Há
evidências da necessidade da vitamina E para a eritropoiese e a
manutenção da integridade dos eritrócitos (RICE
& KENNEDY, 1988; LEE, 1993; MILLER et al., 1993).
A influência da suplementação de vitamina E no controle da mastite bovina tem sido descrita. ATROSHI et al. (1986), ATROSHI et al. (1996) e BATRA et al.
(1992) registram uma menor incidência de mastite em animais com
concentrações mais altas de α-tocoferol, o
principal composto da vitamina E. A concentração
sérica de α-tocoferol em cabras tende a diminuir nas duas
primeiras semanas após o parto e a suplementação
dos animais com vitamina E evita a alteração (PAES,
2000a). Em cabras primíparas desafiadas com a
inoculação intramamária de Staphylococcus aureus,
menores contagens de células somáticas (CCS) e de
microrganismos no leite dos animais suplementados com vitamina E foram
descritas (PAES et al., 2003).
O presente
trabalho teve por objetivo avaliar os efeitos da
administração de vitamina E sobre os eritrócitos
de cabras desafiadas com a inoculação intramamária
de Staphylococcus aureus ao décimo dia pós-parto.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi
realizado nos Laboratórios Clínico e do Núcleo de
Pesquisa em Mastite (NUPEMAS) da Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade Estadual Paulista
(UNESP), Campus de Botucatu, SP. Foram usadas 28 cabras,
primíparas, da raça Saanen, na faixa etária de dez
a dezesseis meses, distribuídas, aleatoriamente, para quatro
tratamentos, cada um com sete animais. O primeiro tratamento (controle)
foi denominado TC; o segundo, composto por animais suplementados com
vitamina E, denominado TV; o terceiro, constituído por animais
desafiados com Staphylococcus aureus, foi chamado de TM e o quarto tratamento, composto por animais suplementados com vitamina E e desafiados com Staphylococcus aureus, denominado TVM. A dieta dos animais era constituída de concentrado, feno de coast-cross, sal mineral e água ad libitum.
No momento controle, foram realizadas avaliações na carga
microbiológica, na contagem de células somáticas
(CCS) e no california mastitis test (CMT) do leite. A
suplementação de vitamina E constou de duas
aplicações, por via intramuscular de 20 mL de acetato de
DL-α-tocoferol, em veículo oleoso, correspondendo a 2.000
UI, no dia do parto e no sétimo dia após o parto. Como
inóculo, utilizou-se Staphylococcus aureus
cepa ATCC 25923. Foram inoculados 10 mL de solução salina
contendo 300 unidades formadoras de colônia (UFC) de Staphylococcus aureus
na glândula mamária esquerda das cabras do TM e do TGVM no
décimo dia após o parto. Os animais desafiados com Staphylococcus aureus,
isto é, em TM e TVM, foram tratados com 200 mg de cefapirina
sódica infundidos na glândula mamária esquerda, por
três dias consecutivos, terceiro, quarto e quinto dia após
o isolamento do microrganismo no leite.
As
variáveis foram avaliadas em sete momentos como a seguir
especificado: 1. MC, momento controle, considerando a média do
resultado de três colheitas, realizadas no oitavo, nono e
décimo dia após o parto; 2. MM, momento mastite, momento
do isolamento do Staphylococcus aureus no
leite dos animais desafiados, décimo primeiro dia após o
parto em TC e TV e décimo primeiro ou décimo segundo dia
após o parto, conforme o dia do isolamento, em TM e TVM; 3.
M12h, doze horas após MM; 4. M24h, 24 horas após MM; 5.
M48h, 48 horas após MM; 6. M72h, 72 horas após MM; 7.
M168h, sétimo dia após MM, 48 horas após o
término do tratamento no TM e no TVM.
Amostras de
sangue foram obtidas em tubos a vácuo mediante
punção da jugular, sendo 5ml com o anticoagulante
ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), sal
sódico, em solução aquosa a 10% para a
realização do eritrograma e contagem de
reticulócitos e 5ml com o anticoagulante heparina sódica
na razão de 143 UI/mL, para determinação da
glutationa eritrocitária. Determinaram-se a contagem total de
hemácias, a concentração de hemoglobina, o volume
globular, o volume corpuscular médio, a
concentração de hemoglobina corpuscular média e a
hemoglobina corpuscular média utilizando-se contador
eletrônico de células. A observação de
anisocitose foi realizada em esfregaço de sangue
periférico, conforme JAIN (1986). Fez-se a contagem de
reticulócitos de acordo com COLES (1984). Para a
determinação da glutationa eritrocitária reduzida
(GSH), usou-se a técnica descrita por KOHAYAGAWA (1993).
A
análise estatística dos dados foi feita pelo teste
não paramétrico de Friedman para a
comparação dos resultados dos momentos dentro de cada
tratamento e o de Kruskal-Wallis para a comparação dos
tratamentos dentro de cada momento, ao nível de
significância de 5,0% (ZAR, 1984).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em todos os
animais, a carga microbiológica foi negativa, e a contagem de
células somáticas (CCS) e o california mastitis test
(CMT) encontraram-se, de acordo com o proposto por PAES (2003), dentro
da faixa de normalidade para cabras primíparas na primeira fase
da lactação. Nos momentos seguintes, os exames do leite
dos animais do TC e do TV apresentaram resultados semelhantes aos
observados no momento controle. Nos animais do TM e do TVM foram
isolados Staphylococcus aureus em, pelo menos, dois dos cinco momentos
posteriores ao desafio microbiano e anteriores ao tratamento. Nestes
momentos também se observaram diferenças significativas
(p<0,05) na CCS e no CMT em relação ao momento
controle, indicando a existência de mastite.
Os resultados
da contagem total de hemácias, da concentração de
hemoglobina (Hb) e do volume globular (VG) das cabras nos respectivos
tratamentos e nos momentos avaliados encontram-se na Tabela 1.
No momento
controle dos quatro tratamentos, as medianas da contagem total de
hemácias, da concentração de Hb e do VG (Tabela 1) tiveram valores semelhantes aos relatados por JAIN (1986), MARQUES JÚNIOR et al. (1990) e PAES et al.
(2000b). Ao longo do experimento ocorreram diminuições
nesses valores em todos os tratamentos. No entanto, não
ultrapassaram os limites mínimos de referência propostos
por JAIN (1986). Esses decréscimos ocorreram com maior
notoriedade no momento M48h. Segundo WANER & HARRUS (2000), a
anemia da doença inflamatória (AID) pode ocorrer em um
período de três a dez dias após o início do
processo inflamatório, o que poderia justificar a
diminuição das variáveis no TM e no TVM. A AID,
entretanto, não justifica os decréscimos semelhantes
observados no TC e TV. Possivelmente, o estresse causado pelas
colheitas sucessivas possa responder por tais alterações,
já que, durante os momentos MC a M24h, foram colhidos cerca de
180mL de sangue em quatro dias, o que representa aproximadamente 9,0%
do sangue total do animal.
Após o
intervalo de cinco dias, entre os momentos M72h e M168h, apenas nos
tratamentos onde os animais foram suplementados com vitamina E ocorreu
o retorno aos padrões-controle na contagem total de
hemácias, na concentração de Hb e no VG. Ao
contrário, nesse intervalo, os animais não suplementados
apresentaram diminuição nessas variáveis, embora
não estatisticamente significativa (p>0,05) (Tabela 1).
Já que a
carência de vitamina E pode diminuir a sobrevida das
células e prejudicar a efetividade da eritropoiese (LEE, 1993),
a suplementação dos animais com vitamina E pode ter
beneficiado o processo de produção dos eritrócitos
na medula óssea, assim como mantido uma maior quantidade de
eritrócitos íntegros na circulação
periférica. Os resultados sugerem que a vitamina E, independente
dos mecanismos envolvidos, leva a uma melhor resposta
eritrocitária em caprinos. Entretanto, HAWKEY et al.
(1984) não observaram correlação entre os
níveis séricos da vitamina E e os valores
hematológicos em ovinos.
Não
foram observados reticulócitos nos esfregaços de sangue
periférico corados com o novo azul de metileno, assim como
alterações na policromasia dos esfregaços corados
com Giemsa. Nos ruminantes, segundo JAIN (1993), a
liberação de reticulócitos da medula óssea
para o sangue periférico ocorre apenas sob estímulo
intenso da medula óssea. É, portanto, rara a
observação dessas células no esfregaço de
sangue periférico, o que, consequentemente, determina uma menor
possibilidade de alterações nos índices
eritrocitários, VCM, CHCM e HCM. Entretanto, estimulada pelo
hormônio eritropoietina, a eritropoiese efetiva pode ser
realizada com um menor número de divisões celulares,
produzindo, dessa forma, eritrócitos maiores (DESSYPRIS, 1993).
Os valores dos índices eritrocitários, no presente
experimento, apresentaram variações mínimas. Isso
sugere que as diminuições dos valores da contagem total
de hemácias, da concentração de Hb e do VG
não apresentaram amplitude suficiente para estimular o aumento
da liberação de eritropoietina e, consequentemente, a
liberação de reticulócitos e eritrócitos
maduros maiores da medula óssea.
As
concentrações da glutationa eritrocitária (GSH)
das cabras apresentaram valores mínimo, médio e
máximo de 61,7; 96,4 e 160,6 mg/100mL de eritrócitos,
nessa ordem. Portanto, todas as cabras apresentaram valores superiores
a 60 mg/100mL de eritrócitos, o que caracteriza esses animais,
segundo a definição de AGAR et al. (1974), como do tipo “alta concentração de GSH”. Resultados semelhantes foram descritos por AGAR et al. (1974), MORENO et al. (1987) e VALLEJO et al.
(1989). O GSH não apresentou diferença significativa
(p>0,05) entre os tratamentos e nem nos momentos avaliados.
A mastite
não exerceu influência significativa nos valores do
eritrograma e na concentração de glutationa
eritrocitária, sugerindo que a resposta do organismo contra a
enfermidade não apresentou amplitude suficiente para provocar
alterações nos eritrócitos.
CONCLUSÃO
Conclui-se que a inoculação de Staphylococcus aureus
na glândula mamária não altera o eritrograma e a
glutationa reduzida eritrocitária e que a vitamina E favorece,
positivamente, uma melhor resposta eritrocitária.
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