ATIVIDADE VIRAL DO VÍRUS RESPIRATÓRIO SINCICIAL BOVINO (BRSV) EM BEZERROS
LEITEIROS
Ingrid Bortolin
Affonso1, Sandra Possebon Gatti2, Andréa Souza Ramos de
Medeiros3, Maria da Glória Buzinaro4, Samir Issa Samara4
O
vírus respiratório sincicial bovino (BRSV) é um dos principais patógenos que
acometem o sistema respiratório de bovinos jovens, causando sérios prejuízos
econômicos. Dados sobre sua epidemiologia e ocorrência em animais até um ano de
idade são escassos na literatura brasileira. Assim, este estudo teve como
objetivo determinar a ocorrência da atividade viral do BRSV em três rebanhos
leiteiros soropositivos, por meio do monitoramento sorológico de bezerros, desde
o primeiro dia de vida até os animais completarem um ano, utilizando a técnica
de vírus-neutralização. Os resultados mostraram que, nos animais das
propriedades A e B, os títulos de anticorpos aumentaram nos primeiros meses,
caracterizando uma resposta à ingestão do colostro e que, com o passar do tempo,
foram decrescendo e apresentando total ausência no sexto e oitavo mês,
respectivamente, com aumento de títulos nos meses finais do período de colheita,
devido provavelmente a uma infecção natural a campo. Na propriedade C, apesar de
ocorrer dinâmica semelhante às demais, não houve período de total ausência de
anticorpos, sugerindo que os animais podem ter sido infectados nos primeiros
meses de vida, mesmo na presença de anticorpos colostrais. Por meio do
monitoramento sorológico de bezerros foi demonstrada a atividade fluente da
infecção pelo BRSV entre os animais, em todas as propriedades
analisadas.
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PALAVRAS-CHAVE: atividade viral; monitoramento; título
de anticorpos; vírus-neutralização; vírus respiratório sincicial bovino.
BOVINE
RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS (BRSV) ACTIVITY IN DAIRY CALVES
ABSTRACT
Bovine respiratory syncytial virus (BRSV) is one of the major
pathogens affecting the respiratory system of young cattle, causing serious
economic losses. Data on its epidemiology and occurrence in animals under
one-year of age are still scarce in the literature. This study aimed to
determine the occurrence of viral activity in three of BRSV seropositive dairy
herds (A, B, and C), by serological monitoring of calves from the first day of
life until the age of one year, by virus neutralization test. Results showed
that in animals from farms A and B, antibody titers increased in the first
month, characterizing passive transfer of immunity through colostrums. Over time, the titers decreased till total
absence in the sixth and eighth months respectively and then antibodies
titration increased in the final months of the study, probably due to natural
infection. On property C, although there was a similar antibodies’ dynamics to
the others, a period of total absence did not occurred, suggesting that animals
may have been infected in the first months of life, despite the presence of
colostral antibodies. This study demonstrated fluent
BRSV activity amongst animals in all properties.
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KEYWORDS: antibody titer; bovine respiratory syncytial virus;
screening; viral activity; virus neutralization.
INTRODUÇÃO
O vírus respiratório sincicial bovino (BRSV) é considerado um
importante agente patogênico que está associado a episódios de doença
respiratória, especialmente em animais jovens. Faz parte do complexo doença respiratória bovina e é responsável por
determinar grandes prejuízos econômicos à bovinocultura em todo o mundo (BAKER
et al., 1993).
Classificado como membro da família Paramyxoviridae, subfamília Pneumovirinae,
gênero Pneumovirus (INTERNATIONAL
COMMITTEE ON TAXONOMY OF VIRUSES, 2011), o BRSV possui fita única de RNA como
material genético e é envelopado. Por essa característica, é considerado um
vírus muito sensível às condições ambientais (STOTT & TAYLOR, 1985; BAKER
et al., 1993).
A infecção pelo BRSV ocorre em animais de todos os tipos de
exploração pecuária de bovinos, sendo que em áreas endêmicas, a doença clínica é
mais frequente em animais jovens, com menos de 12 meses de idade. Animais
adultos infectados de forma inaparente constituem-se
na principal fonte de infecção para esses animais. O vírus é transmitido para
bovinos suscetíveis por meio de secreções respiratórias e aerossóis, tanto por
contato direto, quanto indireto mediado por fômites
(STOTT et al., 1980; BAKER et al., 1993).
Em consequência da proteção atribuída pelos anticorpos de origem
materna, bezerros com menos de um mês de idade geralmente apresentam a forma
mais branda da enfermidade. Entretanto, devido ao decréscimo dos anticorpos
colostrais, entre um e três meses de idade, a infecção tende a ser mais severa.
Os anticorpos maternos não são eficientes para proteger os animais contra uma
infecção pelo BRSV, porém o aparecimento e a severidade das manifestações
clínicas são inversamente proporcionais aos níveis de anticorpos que o animal
possui (KIMMAN et al., 1988).
Estudos envolvendo o monitoramento sorológico de bezerros já
foram realizados nos Estados Unidos (BAKER et al.,
1986; KIMMAN et al., 1988). BAKER et al. (1986)
mostraram que o período médio de duração dos anticorpos de origem colostral era
de 99 dias e a variação de 30 dias, no mínimo, e de 208 dias, no máximo. Essa
questão é importante, pois a persistência de anticorpos maternos pode
inviabilizar medidas de profilaxia, como a vacinação. No entanto, outros métodos
de profilaxia relacionados ao manejo podem ser utilizados, como a separação
entre animais jovens e adultos e, ainda, o alojamento dos bezerros
individualmente (KIMMAN & WESTENBRINK, 1990).
Em nosso país, apesar de alguns estudos determinarem a
ocorrência do BRSV nos rebanhos por meio de testes sorológicos (DOMINGUES et al., 2002), pouco se sabe sobre a epidemiologia do vírus
no Brasil, e ainda não existem pesquisas relacionadas ao monitoramento de
títulos de anticorpos em bezerros até um ano de idade. Devido a isso, este
estudo foi realizado com o objetivo de determinar a ocorrência da atividade
viral em três rebanhos leiteiros soropositivos para o BRSV da região noroeste do
Estado de São Paulo, por meio da análise do soro sanguíneo de bezerros, desde o
primeiro dia de vida até os animais completarem 12 meses.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi conduzido em três propriedades rurais que criavam
bovinos para a produção de leite, em regime de confinamento, com predomínio da
raça holandesa. Os rebanhos estavam localizados em três municípios situados na
região noroeste do Estado de São Paulo. A propriedade A, na cidade de Viradouro,
possuía um rebanho de 140 animais; a propriedade B, localizada em Altinópolis,
contava com 380 animais; e a propriedade C, na cidade de Jaboticabal, com 80
animais. Todas as propriedades apresentavam condições semelhantes no que se
refere ao manejo nutricional, trânsito de animais, ausência de vacinação contra
BRSV e ocorrência de enfermidades.
Por meio de uma análise sorológica prévia com o emprego da
técnica de vírus-neutralização (VN) em amostras representativas dos animais
adultos (>1 ano) dessas propriedades, foram determinadas as seguintes
prevalências de BRSV: 45,6%, 84,4% e 59,1%, respectivamente, para as
propriedades A, B e C (AFFONSO et al., 2011).
Para o monitoramento sorológico, dez bezerros de cada
propriedade foram selecionados de forma aleatória. Esses animais, logo após o
nascimento, permaneceram com suas mães para a ingestão de colostro. Caso isso
não ocorresse espontaneamente, o colostro era ordenhado e administrado
artificialmente por mamadeiras. Em seguida, os bezerros foram colocados em
bezerreiros individuais, nos quais permaneceram por 60 dias até o desmame e,
depois, foram transferidos para piquetes agrupados em lotes de acordo com a
faixa etária. Amostras de sangue dos 30 bezerros foram colhidas nos dias 1, 2 e
15 e depois mensalmente até os animais completarem 12 meses de idade. Para a
colheita de sangue, foram utilizados tubos tipo Vacutainer® de 10 mL,
sem anticoagulantes, e agulhas hipodérmicas descartáveis. Dessa forma, o
material foi transportado para o laboratório, centrifugado por 15 min a 1.800 G,
e o soro separado em alíquotas de 1 mL, em tubos tipo Eppendorf®, que permaneceram armazenados em
freezer a
Para a pesquisa e titulação de anticorpos contra o BRSV nos
soros dos animais foi utilizada a VN de acordo com protocolo proveniente do
Laboratório de Viroses de Bovídeos, do Instituto Biológico de São Paulo, SP,
descrito por AFFONSO (2010). Como antígeno foi utilizada uma amostra de BRSV padrão estrangeira (ATCC
VR-1485), gentilmente cedida pela Drª Edviges Maristela Pituco,
responsável técnica pelo Laboratório de Viroses de Bovídeos do Instituto
Biológico de São Paulo, SP.
As amostras foram previamente inativadas em banho-maria a 56ºC
por 30 minutos e depois examinadas em duplicata pelo teste de VN. O teste foi
realizado em microplacas de 96 cavidades com diluições de soro a partir de 1:2
até a diluição 1:1024. O antígeno, anteriormente
titulado pelo método de REED & MUENCH (1938), e ajustado a uma concentração
de 200 TCID50 foi adicionado nas cavidades que continham soro. A
mistura soro-vírus foi incubada por 1 hora em temperatura de 37°C e, em seguida,
foram adicionadas células de linhagem contínua de rins de bovino Madin & Darby bovine kidney (MDBK, ATCC CCL-22),
cultivadas em meio essencial mínimo sem antibióticos (MEM; GIBCO BRL), e adicionadas de 10%
de soro fetal bovino (SFB; CULTILAB). As microplacas foram incubadas em estufa
com tensão de CO2 controlada a 5%, em temperatura de 37ºC por um
período de 96 horas.
O título foi expresso como o inverso da diluição capaz de
neutralizar as 200 TCID50, calculado por meio de média geométrica.
Após as médias serem efetuadas, os valores dos títulos foram transformados em
logaritmo de base 10. As amostras consideradas positivas foram aquelas que
inibiram o efeito citopatogênico do vírus a partir da
diluição 1:2, ou seja, títulos maiores ou iguais a 0,30, correspondendo ao
logaritmo decimal da primeira diluição (1:2).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A presença de anticorpos contra determinadas doenças em bezerros
muito jovens está relacionada, em um primeiro momento, à transferência passiva
de anticorpos maternos através do colostro. No caso do BRSV, os anticorpos de
origem colostral em bezerros permanecem no organismo, em média, por
aproximadamente três meses (BAKER et al., 1986). No
entanto, esses anticorpos não são suficientes para proteger os animais contra
uma infecção natural pelo vírus, apesar de a ocorrência da enfermidade e
severidade dos sinais clínicos estarem diretamente relacionadas com a quantidade
de anticorpos específicos circulantes (KIMMAN et al.,
1988).
Os resultados do presente estudo, incluindo as três
propriedades, estão apresentados na Figura 1. Pode ser
observado que, com algumas variações, num primeiro momento são identificados
anticorpos nos soros desses animais, que devem ter origem colostral. No decorrer
das análises, os títulos de anticorpos foram decrescendo até o completo
desaparecimento em alguns animais em determinados períodos. Logo após, os
anticorpos foram novamente detectados, inclusive com aumento na média dos
títulos dos bezerros até o final do estudo, quando eles completaram 12 meses de
idade, provavelmente devido ao contato com vírus de campo.
Os resultados referentes aos títulos de anticorpos
neutralizantes para o BRSV nos soros sanguíneos de bezerros, determinados por
meio do teste de VN para a propriedade A estão apresentados na Tabela 1. Pela
análise das médias, os títulos foram crescentes desde o nascimento até os 15
dias de idade e começaram a decair a partir do primeiro mês de vida. Em média, o
título foi negativado no oitavo mês. A partir do nono mês, os animais voltaram a
apresentar o título mínimo (0,30), que foi aumentando com ligeira elevação
mensal nos meses subsequentes.
A análise dos dados de cada animal revelou que o menor tempo de
duração dos anticorpos de origem colostral foi de quatro meses, e o maior de
oito meses, com média de 5,6 meses entre os animais que se tornaram negativos no
monitoramento. Alguns bezerros não se tornaram negativos no teste ao longo do
tempo, o que dificultou deduzir quando ocorreu o desaparecimento dos anticorpos
colostrais. A queda do título para níveis mínimos e a imediata elevação sugere
que, mesmo ocorrendo o desafio com o vírus selvagem, a presença dos anticorpos
maternos impediu a replicação viral com consequente produção de título
infeccioso. Porém, tão logo eles desapareceram, foram substituídos por títulos
relativos à infecção.
Apesar da prevalência de BRSV encontrada nos animais adultos
dessa propriedade ser menor que as demais (45,6%, AFFONSO et al., 2011), os bezerros foram os que apresentaram os
maiores títulos de anticorpos, do início ao final do estudo.
Mesmo apresentando a maior persistência de anticorpos colostrais
(período de oito meses), alguns bezerros dessa propriedade foram acometidos por
doença respiratória, sendo a enfermidade confirmada em animais de todas as
idades. Como foi evidenciada a infecção pelo BRSV por meio dos exames
sorológicos, esse pode ter sido uma das causas dessas doenças.
Para a propriedade B, os títulos de anticorpos provenientes da
análise dos soros dos dez bezerros estão na Tabela 2. Semelhante à propriedade
anterior, de uma maneira geral, houve aumento dos títulos de anticorpos após o
nascimento até o décimo quinto dia de idade. Após esse período, ocorreu uma
diminuição gradativa dos títulos de anticorpos desses animais, do primeiro mês
até o quinto mês de idade, dado diferente do observado na Propriedade A. Do
sexto ao oitavo mês, os animais não apresentaram títulos para o BRSV, porém após
o nono mês até o final do estudo foi observado um discreto aumento mensal nos
títulos de anticorpos.
Nessa propriedade foi identificado o bezerro que apresentou o
menor (um mês) e o maior (seis meses) período de persistência de anticorpos
colostrais, com média de 4,7 meses entre os animais que se tornaram negativos ao
longo do estudo.
Três bezerros não foram, em nenhum momento, negativos no teste,
o que impossibilitou avaliar o momento em que deixaram de apresentar anticorpos
de origem materna e passaram a ter títulos de anticorpos por possível indução
antigênica.
Mesmo possuindo maior prevalência de BRSV (84,4%, AFFONSO et al., 2011), os bezerros analisados não apresentaram
títulos de anticorpos mais elevados do que os títulos observados nas outras duas
propriedades. Pela análise mensal das médias dos títulos, durante três meses a
média foi menor que 0,30, ou seja, o teste foi negativo. Somente a partir do
nono mês, houve aumento paulatinamente do título, até o último mês da pesquisa.
De acordo com os registros, nessa propriedade poucos animais apresentaram
problemas respiratórios. De acordo com diversos pesquisadores (CANCELLOTTI et al., 1980; BOHLENDER et al., 1982; VERHOEFF & VAN
NIEUSTADT, 1984), a indução de anticorpos contra o BRSV em bezerros pode ocorrer
sem que os animais apresentem doença clínica. Dessa forma, os dados observados
podem indicar que os animais em questão entraram em contato com o vírus, soroconverteram, mas só alguns apresentaram sinais
clínicos.
Em relação à propriedade C, o monitoramento dos títulos mostrou
uma diferença marcante em relação às demais, pois em nenhum momento as médias
mostraram total ausência de anticorpos (Tabela 3). As médias dos títulos de
anticorpos dos bezerros mostraram que houve uma tendência crescente até os 15
dias e depois decrescente do primeiro mês até o quinto mês, com ligeiro aumento
no quarto mês de idade. No quinto e sexto meses, os títulos permaneceram
constantes, sem indicação de desaparecimento dos anticorpos, para, em seguida,
já no sétimo mês, ocorrer um aumento nos títulos de forma crescente até o nono
mês de idade dos bezerros. No décimo mês houve uma queda do título e, logo nos
meses seguintes, os títulos voltaram a subir e tornaram a diminuir. Analisando
individualmente os bezerros dessa propriedade, a maioria dos títulos dos animais
em nenhum momento tornou-se negativa. Como já mencionado anteriormente, também
nesse caso fica impossível distinguir anticorpos de origem materna daqueles
provenientes de infecção. Alguns bezerros tornaram-se negativos no teste em
algum momento da pesquisa, sendo o período mínimo de permanência de anticorpos
colostrais encontrado de três meses e o máximo, de quatro meses, com tempo médio
de 3,7 meses.
Apesar de a propriedade C ter apresentado prevalência
intermediária de BRSV (59,09%, AFFONSO et al., 2011),
não houve período com total ausência de anticorpos. Conforme registros, nessa
propriedade, os animais apresentaram esporadicamente sinais clínicos de doença
respiratória, observados em todas as idades.
Para BAKER et al. (1986), os anticorpos
maternos não são capazes de proteger os bezerros contra uma infecção pelo BRSV.
Por essa premissa, provavelmente ocorreu uma infecção dos bezerros com vírus de
campo nos primeiros meses de vida, mesmo na presença de anticorpos maternos, o
que pode caracterizar a dinâmica dos títulos observada nesta propriedade.
CONCLUSÕES
A sorologia realizada em etapas pareadas em animais jovens pode
mostrar a mais recente atividade do agente viral em um determinado rebanho. No
caso do presente estudo, a atividade viral foi confirmada pelo monitoramento
sorológico de bezerros que, com algumas particularidades dentro de cada rebanho,
constatou o declínio natural dos anticorpos contra o BRSV ao longo do tempo,
desde o primeiro mês de vida. Em alguns animais, também foi possível estabelecer
a duração da imunidade de origem colostral, devido ao desaparecimento dos
títulos de anticorpos, porém, em outros bezerros, ela não pode ser determinada,
provavelmente por ter ocorrido infecção pelo vírus de campo. Deste fato pode-se
deduzir que a presença de anticorpos colostrais não
impede a infecção dos animais. A detecção de títulos crescentes de
anticorpos é um fator que comprova a atividade contínua de re-infecções pelo BRSV entre os
animais, em todas as propriedades.
AGRADECIMENTOS
Os autores
agradecem à Drª Edviges Maristela Pituco e Drª. Claudia Pestana Ribeiro do Instituto Biológico de São
Paulo por fornecer a amostra viral, pelos protocolos e por toda a assistência
dispensada. À FAPESP pelo auxílio concedido (Processo nº 2008/56693-6) e ao CNPq
pela bolsa de estudo (Processo nº 561765/2008-1).
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